Способ получения меченого белка

 

Г.М. Ротт, Ю.A. Семин, В.И. Домбровский, А.М. фверенный, С.О. Вязов и Н.В. Дорошенко

Й,. (72) Авторы изобретения

Научно-исследовательский институт медицинской радиологии-=

АМН СССР (7l ) Заявитель (4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЕЧЕННОГО БЕЛКА

Изобретение относится к улучшенному способу получения меченного белка, биологически активного соединения, которое может найти применение в биологии и медицине для радиационной диагностики различных заболеваний.

Известны меченные. белки, которые различаются природой изотопа, обуславливающего радиоактивность, и.методами введения данного изотопа .в молекулу белка. Наиболее широко известны способы промечивания белков изотопами иода - 125,). и,131J, являющимися у"ис" точниками Г1 3 и (23

При этом введение радиоактивного иода осуществляют либо непосредственно в аминокислотные остатки белка, содержащие ароматические группы, либо химической модификацией различных реакционных центров белка специальными реагентами, содержащими изотопы иода.

Несмотря на то, что техника регистрации -излучения проста„ работа с изотопами иода неудобна иэ-за их малого периода полуспада. Кроме того, включение иода в белковую молекулу

5 часто приводит к нарушениям структуры молекулы белка, в частности к изменению антигенной специфичности.

Известны способы введения в белок долгоживущих изотопов трития и углерода-14, обладающих .мягким 6-излучением.

Например, описан способ получения радиоактивного препарата белка реакцией восстановительного алкилирования с использованием .".4С-йормальдегида.

По этому способу на первой стадии ре.акции происходит взаимодействие йормальдегида с е,"аминогруппами, лизина белка с образованием лабильных оснований Ниффв. Вторая стадия реакции заключается в восстановлении лабильных оснований Ниффа, до стабильных метиль6 4

IHbI во-первых, блокированием большого числа Е -аминогрупп белка, а во-вторых способностью боргидрида и цианборгидрида натрия восстанавливать не только основания ЙиФфа, но и карбоксильные группы, сульфидные связи, определяющие стабильность конформации белка.

Целью изобретения является повышение удельной радиоактивности промечиваемого .белка при сохранении,его антигенной специфичности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения меченО ного белка с помощью Формальдегида, заключающеМуся в том, что Формальдегид подвергают взаимодействию с алифатической аминокислотой, меченной тритием или углеродом-14, и образующимся при этом производным общей Формулы — СН- СоаН

I и= сн f

Этот способ. позволяет проводить реакцию восстановления при нейтральных значениях рН и широком температурном интервале (от ОоГ до 37 С), что позвoляет расширить номенклатуру белков, способных к промачиванию при указанных режимах обработки (4 1.

Известные способы обработки белков реакцией восстановительного алкилирования с использованием в качестве восстанавливающих агентов боргидрида и цианборгидрида натрия дают возможность получать меченные белки, сохраняющие антигенную специфичность, с удельной радиоактивностью 0,4-9,0 мкК/

/r белка, которая, однако, часто недостаточна для тестирования микроколи45 честв белка, с которыми приходится иметь дело в биохимических исследованиях. Вследствие того, что радиоактивность меченного препарата определяется количеством " C-формальдегида, необратимо связанного с аминогруппами белка, данный метод не позволяет получать препараты с большей удельной радиоактивностью, чем указано выше, без нарудения антигенной специфичности белка, Изменения в структуре белка при использовании значительных количеств Формальдегида и, особенно,, восстанавливающих агентов, обусловле96803 ных групп при помощи боргидрида нат рия. Обработка белков данным способом осуществляется при рН близком к 9,0 в температуре около 0 С (3 1.

Недостатком метода является узкий диапазон значений рН и теипературы обработки белка, связанный с неустой- чивостью боргидрида натрия. При помощи метода восстановительного алкилиро-. вания с использованием боргидрида нат-1О рия можно промечивать только ограниченный круг белков, стабильных именно при данных строгих параметрах обработки.

Наиболее близким к предлагаемому является опрсоб получения меченных тритием или углеро дом 14 белков, который состоит в обработке белка радио1 ктивным Формальдегидом с последующи . восстановлением образующихся лабильных оснований Пи@фа до стабильных соединений цианоборгидридом натрия

If

ejjjj — сч с e— - ч сч .т т ВаЬН СН ,e — ч = счт — — Б Йч-Счт

rpeg - Н;

Н " алкил или "4С-алкил, обрабатывают белок в водном буферном растворе при рН 5,5-10,0 и температуре 20"48 С, при молярном соотношении компонентов формальдегида, аминокислоты и белка 0,045-0,060:1,9х10 4х 10 З:10 -10

Предпочтительными вариантами проведения процесса являются использование в качестве водного буферного раствора фосфатного и боратного буферов; в качестве алифатической аминокислоты используют Н-лизин, Н-глицин

3 лтС-.лейцин.

Предлагаемый способ позволяет получить белок с удельной радиоактивностью 120-909 мкК/мг белка.

Антигенная специфичность белка, промеченных путем восстановительного алкилирования в указанных концентрационных параметрах Формальдегида и восстановителя, также практически не изменяется.

Однако нельзя получить более высокопромеченные препараты белков методом восстановительного алкилирования формальдегида без серьезного нарушения антигенной специфичности.

Для экономного расходования радиоактивных аминокислот, белков и прочих материалов важное значение имеет возможность получения высокопромеченных белков с заданной удельной радиоактивностью путем варьирования удельной

36 6 ничиваются областью устойчивости каждого конкретного белка.

Меченный белок отделяют от низкомолекулярных компонентов элюированием через хроматографическую колонку с се-. фадексом или посредством диализа.

Удельную радиоактивность белка опре- . деляют нанесением пробы объемом

0,02 -мл на мембранный фильтр "Сын" пор" с последующим просчитыванием

f6 излучения и толуольном ацинтилля торе на сцинтилляционном счетчике.

Il р и м е р 1. Для получения меченного тритием человеческого миогло:бина взято на 1 мг белка 10,0 мК моно-гидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 40,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20 С. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью

450,0 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроосмошорезе составлял 1:256, титр нативного белка 1:256.

Il p и м е р ы 2 и 3. Для получения сравнительных данных по влиянию на удельную радиоактивность человеческо" го миоглобина удельной радиоактивности и концентрации используемой аминокислоты, взято на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности соответственно

40,0 К/мМ и;0,25 К/мМ с радиоактивной концентрацией в обоих случаях

1,0 мК/мл. Режим обработки: рН 7,9. и температура.37ОС. В результате промечивания получены белки с удельной радиоактивностью соответственно

617,0 мкК/мг и 175,0 мкК/мг. Титры меченных белков в обоих случаях во встречном электроосмофорезе. составляли. 1:256, титр исходного белка -также

1:256.

fl р и и е р 4. для получения меченного тритием бычьего сывороточного альбумина взято на 1 мг белка

10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 40,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/

/мл. Режим обработки: рН 5,5 и температура 25 С. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 273,0 мкК/мг. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составлял 1 .4096, титр исходного белка 1:4096, Пример 5. Для получения меченного углеродом-14 бычьего сыворо5 9680 радиоактивности или концентрации аминокислот (фиг. 1 и пример 2,3).

Из табл, 2 также видно, что с увеличением температуры возрастает удельная радиоактивность промечюваемого з белка. Однако для каждого конкретного белка имеется верхний предел температурного режима обработки, связанный с денатурационными процессами.

Установлено, что существует опре- 10 деленное значение рН, зависящее от .природы конкретного белка, при котором удельная радиоактивность промечиваемого предлагаемым способом белка достигает максимального значения 15 (фиг. 2).

На фиг. 1 представлена зависимость величины удельной радиоактивности миоглобина, промеченного предлагаемым способом, от концентрации используе- 20 мой радиоактивной аминокислоты, в частности моногидрохлорида Н-лизина;. на фиг. 2 - зависимость величины удельной радиоактивности (а ) миоглобина и (б ) бычьего сывороточного аль- 2$ бумина, меченных предлагаемым спосо-! бом, от величины рН среды. .Совокупность отмеченных преимуществ . способа промечивания белков обеспечивает возможность создания ряда оте- y} чественных комплектов препаратов для радиоизотопного анализа в биохимических и в медицинских исследованиях, например для диагностики инфаркта миокарда и т.д.

Общая схема получения меченного белка.

К 0,1 мл раствора радиоактивной коммерческой алифатической аминокис40 лоты требуемой удельной радиоактивности или концентрации добавляют последовательно 0,01 мл 0,9-1,2 М раст рора формальдегида (оптимально 1,12 M) и 0,1 мл раствора белка концентрации

0,08-0,20 мг/мл. Реакцию белка с

45 рабильными производными формальдегида и алифатической аминокислоты, образующимся практически мгновенно при их смешении, проводят в течение 4 сут так как за это время, согласно кине-. тическим измерениям, взаимодействие практически заканчивается. Процесс промечивания проводят при соответствующем значении рН от 5,5 до 10,0 задаваемым в области рН 8,0-10,0 боратным буфером, а в области. 5,5-8,0 фос" фатным буйером, и температуре 20-48 С.

Режим обработки рН и температура ограТаблица 1

Режим промечивания белок

Пример

Т С рн

М4 f,-леи 3 Н ли 14С- орм" цин зин альдегид

0,058

25 7,0

Извест- Человечный ческий миогло бин

0,20

40,0

10,0

1 Тоwe 20 10 0

2 -"- 37 79

40,0

1.0, 0

3 -"- 37 79

0,25

10,0

Извест- Бычий 25 7,0 ный сывороточный альбумин

О;058

П,20

4 То же 25 5,5

5 - " - 37 9,0 54,0

10,0

6 - " - 48 9,0

40 0

10,0

ll p и и е ч а н и е. Числитель - удельная радиоактивность, К/мМ.

Знаменатель — радиоактивная проба, мК/мг белка, 7 968036 8 точного альбумина взято на 1 мг бел- 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина ка 10,0 мК (;-лейцина удельной радио- удельной радиоактивности 40,0 к/мМ активности 54,0 КlмН и радиоактивной и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ концентрации 1,0 мК/мл. Режим обра- /мл. Режим обработки: рН 9,0 и темпеботки: рН 9,0 и температура 37 С ° и ратура 48 Г. В результате промечиваВ результате промечивания получен ния получен белок с удельной радиобелок с удельной радиоактивностью активностью 909,0 мкК/мл. Титр мечен291,0 мкК/мг. Титр меченного белка в ного белка в реакции нейтрализации реакции нейтрализации антител состав- антител составлял 1:4096, титр исходлял 1:4096, титр нативного белка 1о ного белка 1:4096.

1:4096. В .приведенных табл. 1 и ? даны

p a M e p 6 ° Лля получения ме- конкретные примеры составления реченного rio тритию бычьего сывороточ- акционных смесей для получения меченного альбумина взято на 1 мг белка ного белка..

968036

Табли ц а 2

Титр белка

Пример

Удельная радиоактивность белка, мкК/мг

Белок

1:1228

4елоре-, ческий миогло бин

Известный !

Нативный бе1:256

То we лок

450,0

1: 256

1: 256

617,0

1:256

175,0

Известный

1:4096

4,5

Бычий сывороточ" ный альбу лин

1:4096

Нативный То же белок

1:4096

1:4096

1:4096

273,0

291,0

909 0

Пример 7. Получение меченного человеческого миоглобина при использовании Ьормальдегида с концентрацией меньшей нижнего предела.

Для получения меченного тритием человеческого миоглобина взято на 1 кг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-ли3 зина удельной радиоактивности 40,0 К/

43

/мМ и радиоактивной концентрации

1,0 мК/ил, при этом концентрация белка в пробе составляла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20 С.

Концентрация используемого. формальдегида 0,04 М. В результате промечиваSO ния в течение 4 сут получен белок с удельной радиоактивностью 280 мкК/мг, в течение 8 сут 320 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электро" осмойорезе составлял 1,256, титр нативного белка - 1:256.

ll р и м е р 8. Получение меченно го бычьего сывороточного альбумина при использовании формальдегида с концентрацией больней верхнего предела..

Для получения меченного тритием. бычьего сывороточного альбумина взято на 1 кг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 40,0 К/мМ .и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл, при этом концентрация белка в пробе составляла

10,0 мкг. Режим обработки: рН 5,6., температура 25ОГ. Концентрация используемого формальдегида 0,08 М. 8 результате промечивания в течение

2 сут получен белок с удельной радиоактивностью 120 мкК/мг, в течение

4 сут 270 мкК/мг. Титр меченного бел-. ка в реакции нейтрализации антител составляет: через 2 сут ийкубации 1:

2048, через 4 сут - 1:1024,. Титр нативного белка - 1: 4096.

Пример 9. Использование H-глицина в качестве меченной аминокислоты. что полученные результаты сопоставле" ны (табл, 3).

В табл. 3 приведены результаты параллельного радиоиммунологического определения уровня миоглобина в сыворотках больных инфарктом миокарда, полученные при использовании,J-миоглобина (Sorin Biomedica, Италия) и

Н-миоглобина, .промеченного предлагаемым способом.

Таблица 3

Уровень миоглобина в сыворотках больных инфарктом миокарда, (г/мл х 10 ) 3Н 125

275

259

625

290

317

341

Больной Н.

428

Больной Е.

487

519

475

Больной Ц.

859

335

Больная Д.

192

Больной Г.

Формула изобретения

1. Способ получения меченного бел ка с помощью формальдегида, о т л ич а D шийся тем, что, с целью повышения удельной радиоактивности белка при сохранении его антигенной специфичности, формальдегид подвергают взаимодействию с алифатической аминокислотой, меченной тритием, или,углеродом-14 и образующимся при этом производным общей формулы

Ф

Я вЂ” CH-COOH

g — СН где Я - Н; Н - алнил или С-алкил, l1 96803Г> 12

Для получения меченного тритием человеческого миоглобина взято на

1 мг,белка 12,5 мК, 3Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл, при 5 этом концентрация белка в .пробе составляла 8,0 мкг. Режим обработки: рН 8,0 и температура 37ОС. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 310 мкК/мг. 10

Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составлял 1:256, титр нативного белка: 1:256. Меченный миогло

Пример 10. Использование бин Н-глицина в качестве меченной амина- 1б ки слоты.

Для получения ме ченно ro тритием человеческого ииоглобина взято на 1 мг белка 5,0 мМ 3Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактив- 20 ной концентрации 11,0 мК/мл,, при этом Здоровый донор 15-85 концентрация белка составляла 20,0 мкг в пробе., Режим обработки: рН 8,0 и Больной К. температуре 37ОC. В результате промечивания получен белок с удельной 2з Больной Н. 671 радиоактивностью 130 мкК/мг. Титр ме ченного белка во встречном электро- Больной Л, осмофорезе составлял 1:526, титр нативного белка — 1:256. 3 11

Сохранность антигенной специфич- gO ности человеческого миоглобина прове- 406 рена во встречном электроосмофорезе, сохранность антигенной специфичности Больной Б. бычьего . сы вороточного альбумина проверена в реакции нейтрализации анти- 456 тел.

Данные табл. 2 показывают, что по . Больная О. 871 сравнению с известным способом значительно увеличивается удельная радио- 302 активность белков, промеченных пред- 4О лагаемым способом, что позволяет про 215 водить биохимические и медицинские исследования с меньшими концентрациями белков.

Так получен Н-миоглобин высокой

3 удельной радиоактивности без нарушения его антигенной специфичности. На основе этого препарата метод радиоиммунологического определения уровня миоглабина в сыворотках позволяет определять миоглобин в концентрации не менее 15 х 10 >г/мл.

В результате параллельного определения уровня миоглобина в сыворотках больных и здоровых людей с помо° ° „55 щью импортного набора (Sor>n Biome" д>са, Италия) и с помощью описываемой методики, где меченным антигеном . является Н-миоглобин, оказалось, Х мм/ма

3 фиа1

13 9680 обра(вкатывают белок в водном буферном растворе при рН 5,5-10,0 и температуре 20-48 С при молярном соотношении о формальдегида, аминокислоты и белка

0,04 -0,060:1,9х10 -4x10 :11Г - 10 5

2. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве водного буферного раствбра используют фосфатный и боратный буферы.

3. Способ по и, 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве алифатической аминокислоты используют ЗН-лизин, Н-глицин и "4Г"лейцин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. BoEton A.F., Hunter M.М. The

EabeEF,in of proteins to high specific radioactivities by conjugation

ы 7N

k ь бО

Ъ ь

5 м

3 а ФОО

Ь

Ъ

2N г foo

36 14 .

to а 125,!-rontainincj acyFating agent

AppFication to the radIoimmunoassay.

Biochem. J. 1973 133, 8 3, 529.

2. Greenwood F.Ñ., Hunter 1!.И. The ргерагation of 131J-FabeFPed human

growth hormone of hi.gh specifiс radioactivitg, Riochem. j. 1963, 89, N

114.

3. Rice R.Н., Reans G.Е. Radioactive FaheFFinq of protein in viti.o, j.Biol.Ñhåm,1971, 246, N 3, 331.

4. Dottarlo-tlartin D., Ravef,).È.

RadioFabeP1iing of proteins hy reduct i ve а бсy Fa t i on и1 th ("4С )- forma Fde"

hyde and sodium cyanoborohydride

AnaE. Riochem, 1978, 87, N 2, с. 562 (прототип).

Э68036

f0 рН

Корректор С. Йекмар

Составитель В. Волкова. Редактор Г. Волкова Техред И, Коштура

Заказ В025/38 Тираж 388 Подписное

ВВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам иэобретений и открытий

1130) Москва„ Н-Я Раушская наб.д g. 4/5 филиал ППП нПатейт"., г. Ужгород, ул. Проектная, ч