Способ концентрирования и очистки вирусных суспензий
П.Д. Решетов, Л.С. Жигис, А.С. Хохлов, ф.С. Но
А.И. Крашенюк, А.Ь. Иебрун, А.В. Чистяков и В.
Институт биоорганической химии им. М.И. Шемякйиа и Ленинградский ордена Трудового Красного Знфмени.",.:.научно-исследовательский институт эпидемиологии ., gC, и микробиологии им. Пастера (72) Авторы изобретеияя
Р1) Заявйтели (54) СПОСО6 КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ
ВИРУСНЫХ СУСПЕНЗИЙ
Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в меди«
l цинской и микробиологической промышленности.
Известен способ концентрирования и очистки вирусных суспензий путем пропускания вируссодержащей жидкости через полимерные мембраны 1).
Однако известный способ не обеспечивает высокой степени очистки и концентрирования целевого продукта.
Целью изобретения является повышение степени очистки и концентрирования целевого продукта.
Цель достигается тем, что при осуществлении способа концентрирования и очистки вирусных суспензий путем пропускания вируссодержащей жидкости через полимерные мембраны, в качестве полимерных мембран используют полисульфонамидные мембраны с размерами пор 500-2500 А и пропускают вируссодержащую жидкость при избыточном давлении 0,75- 1,0 ати в непрерывном режиме, и при избыточном давлении
1,0-5,0 ати в статическом режиме.
Пример l. 0,65 л ВАБ, вирус гриппа Al {Уфа), антигенная формула
Н Н» с титром в РГА 1: 123 подвергают микрофильтрации в непрерывном режиме и в .режиме диафильтрации в буферном растворе с рН 7,2. Производительность составляет 0,05 мл/сиз мин. Получают
11,5 мл концентрата с титром в РГА
1:16000. Содержание белка, выход по вирусу и белку указаны в таблице.
Пример 2. 2 л ВАБ, вирус гриппа.А1 (Уфа), с титром 1:128 подвергают микрофильтрации, как указано в примере I. 200 мл концентрата с титром 1:32000 обрабатывают коагулянтом, осадок отделяют центрифугиро"
2О ванием (200 об/мин, 20 мин), фильтрат (супернатант) концентрируют микрофильтрацией до 50 мл, титр 1:128000. а затем до 8 мл (т.е. в 250 раз). Со3 9757 держание белка, выход по вирусу и белку приведены в таблице.
Пример 3. 0,75 л ВАИ, вирус гриппа AZ (Техас) 1/77., антигенная формула Н, Й,, титр 1:512 подвергают у микрофильтрации, как указано в примере l. 175 мл концентрата отмывают в режиме диафильтрации в буферном растворе с рН 7,2. Получают 175 мл отмытого концентрата с титром 1:10240 1В (см. таблицу)-. Далее концентрируют в статических условиях до конечного объема 9,2 мл (титр 1:51200).
Пример 4. 0,92 л BAR, вирус гриппа А2 (Техас) i/77, титр 1:2048 И подвергают микрофильтрации в стационарном режиме. Получают 92 мл концентрата с титром 1:20480. Концентрат обрабатывают коагулянтом, осадок отделяют на центрифуге, как указано, щ в примере 2, супернатант отмывают в режиме диафильтрации, затем концентрируют. Получают 31 мл концентрата с титром 1:64000 .(см. таблицу).
Пример 5. 0,53 л ВАИ, вирус 25 гриппа В (Ленинград) титр 1:512 подвергают микрофильтрации, как указано в примере 1. Получают II,5 мл концентрата с титром I:32000. Содержание белка указано в таблице. 30
Пример б. 1.18 л BAN, вирус . гриппа Х-54 (Ленинград), антигенная формула Н Н<, титр 1:16 подвергают микрофильтрации, как указано в примере I. Получают 200 мл концентрата, который отмывают от примесей в режиме диафильтрации до поглощения в фильтрате при P. 280 нм не более 0,1
Титр концентрата l:4096, содержание белка указано в таблице.
П риме р 7. 5л ВАМ, рекомбинантный штамм вируса гриппа Nib-4, антигенная формула Н N,титр 1:128 подвергают микрофильтрации в непре" рывном режиме. Получают 500 мл концентрата с титром 1:1024. Содержание белка дано в таблице.
95 4 концентрата отмывают от примесных белков в режиме диафильтрации при .
4 ати в буфере с рН 6,4 до поглощения в фильтрате при,.) 280 нм не более
0,1 ° Далее концентрируют в статическом режиме. Получают 45 мл концентра» та, титр в РГА 1:64, концентрация белка 1,35 мг/мл, содержание белка
60,75 мг, что составляет 5,13 от суммарного белка, присутствующего в исходной KM. Далее концентрируют до
3,0 мл, титр 1:1024.
Пример 10. 0,2 л КЖ вируса клещевого энцефалита, штамм "Софьин" подвергают микрофильтрации в статическом режиме при 5 ати. Начальная скорость 50 мл/ч, конечная - IO мл/ч.
Получают 3,2 мл концентрата. Концентрацию вируса определяют по цитопатогенному действию на культуре СПЗВ.
В фильтрате инфекционной активности не обнаружено. При концентрировании примерно в 60 раз наблюдают увеличе" ние концентрации белка в 48 раз (с
2,5 до 120,37 мг/мл) и возрастание концентрации вируса примерно в 100 раз.
Пример 11. Культуральную жидкость (КИ) вируса клещевого энцефалита, штамм "Софьин", в обьеме
0,18 л подвергают микрофильтрации в статическом режиме на ПСА-мембранах с диаметром пор 640 А при давлении
5 ати со средней скоростью фильтрации 0,97 мл/ч/см. Получают 3,3 мл концентрата. Концентрацию белка определлют по Лоури. Концентрацию вируса определяют по инфекционной активности на мышах и выражают общепринятым способом в виде 0 Получено: До концент- После рирования концент. рирования П ример 8. 30лВАй, вирус гриппа Al (Уфа), титр 1:1024 подвергают микрофяльтрации, как указано в примере 1. Получают 2,3 л концентрата с титром 1:10240. Пример 9. 2,8 л КХ вируса эпидемического паротита, штамм "Ле" нинград-3", титр в РГА менее 1:2 под- >> вергают микрофильтрации в сатическом режиме. Производительность при 1 ати составляет 0,08 мл/см < мин. 200 мл 3,18 2,40 Белок, мг/мл tgLDФ 107 5 5 28 Пример 12. 2,5 л КМ клещевого энцефалита подвергают. микрофильтрации в непрерывном режиме со средФ ней скоростью фильтрации 2,3 мл/ч/см, Получают 40 мл концентрата. Концентрацию вируса определяют методом флуоресциирующих антител и по инфекционной активности на мышах. Титр в РГА 1: 1024 Получено: 1:8192 До концентрирования После концентрирования 39 2 8 7 Белок, мг/мп д1.0® 1 35 6 7 До концент- После конрирования центрирова. ния Белок, мгlмл 1,45 13,6 Параметры BAN Выход Параметры концентрата Белок Объем, по Лоу- мл ри, мг/мл Итамм Белок, 3 от исходного Белок РГА, по от ис Лоури ходномг/мл го Объем, мл РГА РГА 1:16 10 1:32 10 l:128 10 55 100 43 9 32 100 69,0 68 100 37,0 600 1: 128 2,4 11,5 2200 1: 128 4, 6 200 А1 (Уфа) Al (Уфа) А2 (Техас) 1!77 750 1:512 3,1 175 l:10240 5,6 100 42,0 А2 (Техас) l/77 920 1:2048 1,8 92 1:20480 4,3 100 23,5 Пример 13. Концентрируют вирус бешенства, фиксированный штамм lO "Внуково-32", выращенный на первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. Поддерживающая среда содержит 0,2Я гидролизата лактальбумина и 53 аминопептида. Концентри- И рование проводят в непрерывном режиме на аппарате ФТ-0! при давлении 1,5 ати. Скорость фильтрации 5,3 мл/ч/ум на мембране с диаметром пор 1700 А. Из 3,4 л КЖ получают Зе 175 мл концентрата. Вирус определяют по титру в РГА. Титр в РГА в исход ной КЖ 1:4, в концентрате (1:64) (1:128). П р и.м е р 14. 3,0 л ВАЖ, вирус И гриппа, штамм А/Ленинград/399/76/ /Н и . /концентрируют на ПСА-мембране с диаметром пор 2000 А и пористостью 803 в непрерывном режиме до конечного объема 0,3 л. Концентрацию 3в вируса определяют в РГА, а также по инфекционной активности путем заражения куриных эмбрионов . Получено: Инфекционная активность в ЭИД о 6,5 7,5 сохранение инфекционной активное ти вирусов, возрастание гемагглютинирующей активности в концентратах свидетельствуют об отсутствии ингиби. рующего действия полисульоонамидных мембран на биологические свойства вирусов. Предлагаемый способ концентрирования и очистки вирусных суспензий позволяет существенно повысить технологичность процесса, а именно: про. водить одновременное концентрирование и очистку вирусов из растворов с высоким содержанием белка (например, непосредственно из исходной ВАЖ с концентрацией белка 3-17 мгlмл), концентрировать и очищать вирусы из больших объемов - до 30 л BAQ и КЖ; работать в статическом и непрерывном режимах, а также в режиме диа- . фильтрации; по.единой технологии (с сохранением мембран и оборудования)-проводить концентрирование и очистку различных вирусов. Способ позволяет повысить степень очистки вируса, а именно, в одну стадию удалить 40-90 примесного белка ВАЖ (в случае вируса гриппа) и до 953 примесного белка (s случае КЖ вируса паротита), а такме повысить степень. концентрирования вируса от 6-кратного по известному способу, до 300-кратного в случае ВАМ и до 1000-кратного в случае KN. 975795 Продолжение таблицы Параметры ВАМ Параметры концентрата Выход Втамм в Объем, мл РГА » Белок, Ф от исходного Объем, мл Белок РГА, Ф по от исЛоури, ходномг/мл ro РГА »»»»»»»»» 530 1:512 4,6 11,5 1;32к10 142 100 69,0 1180 1: 16 3,6 200 1: 4096 1:128 4,0 500 1: 4096 60 100 285 196 100 49 0 формула изобретения Способ концентрирования и очистки вирусных суспенэий путем пропускания вируссодержащей жидкости через полимерные мембраны, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения стеИ пени очистки и концентрирования целевого продукта, в качестве полимерных мембран используют полисульфонамид-! Составитель С. Малютина Редактор Н. Егорова Техред Т.Иаточка Корректор Я. Гриценко » Заказ 8936/43 Тирам 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, M-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 В (Ленинград) 14/76 Х-54 (Ленинград) Юь-4 » Белок по Лоури мг/мл ° » ные мембраны с размерами пор 5002500 А и пропускают вируссодермащую жидкость при избыточном давлении 0,75-1,0 ати в непрерывном режиме и при избыточном давлении 1, 0-5,0 ати в статическом режиме. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР И 5И778, кл. С 12 K 7/00, 1975.
