К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. с вид-ву(22) Заявлено 23. 07, 81 (21} 3322984/28-13 с присоединением заявки № (1988867 (5! )М. Кл.

С 12 N 1/14

С l2 И 9/34

Гввударетееккьм квмлтет

СССР.

IIo делам кзввретенкк и вткрытий (23) П риоритет

Опубликовано 15.01.83, Бюллетень № 2

Дата опубликования описания 15.01.83 (53) УДК663 ° 15 (088.8) Т,Н,Писаренко, Е,А,Двадцатова; Б. одзевич, Э.И.Бурцева, Н.Н.Воронцова, И.В,С ьева, M.T,Кочубеева, Г.П.Капюжка, В,С.баааенко и ФчА елюуа у аф

Всесоюзный научно-исследовательский. ййстйтута проду тов брожения

- Л (72) Авторы изобретения (71) Заявитель с (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА

ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ ВИДА

ASPERGILLUS AWAM0RI ПРОДУЦИРУЮЩИХ

ГЛЮКОАМИЛАЗУ (ЕГО ВАРИАНТЫ) 10

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а имен- но к способам приготовления посевно- го материала для культивирования плесневых грибов вида Aspergillus awamori, продуцирующих глюкоаяилазу.

Известны способы приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Aspergillus awamori продуцирующих глюкоамилазу, включающие от одной до четырех стадий пересевов культуры при глубинных условиях культивирования с изменением концентрации среды по крахмалу с 6 до 203. Это способы вегетативного ведения культуры 1 1).

Недостатками данных способов является получение культуры с низкой активностью.

Наиболее близким к предлагаемому является конидиальный способ (21 предусматривающий посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода, соло2 довые ростки и необходимые минеральные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде. В качестве источника углерода используют 10-303 кукурузной муки. Приготовленный посевной материал вводят в количестве

0,01"0,53 в производственную среду, содержащую, Ф: мука 4, вытяжки иэ солодовых ростков 18, (Ng )gS0< 0,6, ИН,1 Н РО1. 016 ° КН Р() 0 ° 1, МДЬО+ О, 05.

Недостатком этого способа является низкая активность культуры, поскольку она не адаптирована к высоким концентрациям углерода °

Цель изобретения - адаптация посевного материала к высококонцентрированным производственным углеродным средам, повышение активности посевного материала и сокращение его рас хода.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготов3 98506 ления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида

Asperg i 11оз awamo r i, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающему посев продуцента на увлажненную питатель ную с реду, содержащую и сточни к углерода, солодовые ростки и необходимые минеральные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование ie на производственной питательной среде, в качестве источника углерода в твердых питательных средах используют 50-90 пшеничных отрубей и 40"

903 муки: кукурузной или ячменной, или рисовой, или ржаной, или маниоки, или соевой, а процесс выращивания продуцента ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в тече- ние 5-6 дней равным 29-31о С, а по до, стижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24 С и осущест вляют вторую стадию также в течение

5-6 сут с последующей селекцией полученных на этой среде конидий в несколько пассажей, при этом в качестве производственной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией

15-25 Б.

При этом при выращивании штамма

Asp. аиащог1 466 селекцию ведут в два пассажа при повышении активности от

100 ед ГлА/г сухой культуры на стадии выращивания до 300 ед ГлА/г

35 сухой культуры после второго пассажа.

Кроме того, увлажнение питательных сред осуществляют раствором следующих солей, вес.4: NANO@ 0,9-1; (НН4) НРО4 0,2-0,3; КН РОр О, 22-0,23;

КС1 0,11-0,12; NgSOp 0,103-0,104;

FeSO4 0,011-О,О15; МпБ0ф 0,05-0,06;

CoSO@ О, 004-0, 00 5; Zn SOp О, 001О, 002; CuSOy О, 004-О, 00 5; вода - остальное.

Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Asp. ewamori, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающий посев продуцента на питательную сре"

50 ду, содержащую источник углерода, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питатель ной среде, посев продуцента осуществляют на среду, содержащую растворимый крахмал 2154, агар-агар 1-2/, и ячменное сусло 7-84, а процесс вы7 4 ращивания ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в течение 5о

6 дней равным 29-31 С, а по достижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут, при этом в качестве производственной питательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерноо все сусло с концентрацией 15-25 S.

Засев посевного материала в производственную питательную среду осуществляют в количестве 0,001250,0051 к объему питательной среды.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Готовят концентрированную по крахмалу твердую питательную среду, содержащую от 50 до 903 пшеничных отрубей с соответствующей добавкой солодовых ростков или от 40 до 90 . маниоки, или ржаной, или ячменной, или рисовой, или кукурузной или соевой муки с соответствующей добавкой солодовых ростков. Увлажняют твердую среду до 60 влажности или просто водопроводной водой или раствором солей следующего состава, вес,Ъ: NaNOy 0,9, (NHg) HPOg 0,2; КН Р04 0,22; КС1 0,11

HgЯ0,1 0,103; FeSOg 0,011; Мп50 0,005

CoS04 0,004; ZnSOy 0,001; CuS0 0,001 вода - остальное.

Культуру выращивают 5-6 дней при

29-31 С, а затем температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторую стадию выращивания также 5-6 дней.

После этого осуществляют селекцию культуры на этой же среде при тех же параметрах и времени. Получают

1 и H пассажи культуры. Готовые пассажи засевают на зерновое сусло, содержащее 15-25 Б. Посев продуцента можно осуществлять на среду, содержащую растворимый крахмал от 2 до 15, агар-агар 1-2 и ячменное сусло 7-84, а затем готовые пассажи засевают на зерновое сусло, содержащее 15-25 Б.

Активность посевного материала с применением концентрированных по крахмалу сред варьирует от 100 до

210 ед/г сухой культуры, а количество спор от 2,2 до 4,2 млрд, конидий на 1 r сухой культуры; Причем наблюдается корреляция активации культур с. увеличением дозировки крахмала и полное отсутствие корреляции в отношении спорообразования.

8ь7 6 сухой культуры, 220 ед/г сухой культуры 1 пассажа, 250 ед/г сухой культуры П пассажа. Зачтем готовую культуру засевают в количестве 70-90 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 18 Бал кукурузное сусло. После

7 сут культивирования активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет для J пассажа 350 ед/мл, 1} пассажа 410 ед/мл, Я пассажа

550 ед/мл, П р и и е р 2. Питательную среду, состоящую из 503 кукурузной муки и

503 солодовых ростков, приготовляют, выращивают и рассевают на пассажи

1 и !! так же, как в примере 1. Полученный конидиальный споровый материал с активностью 250 ед/г сухой культуры засевают 60-80 тыс. конидий на

1 мл питательной среды на 18 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования получают куль гуральную

;жидкость с активностью глюкоамилазы:

1 пассажа 400 ед/мл, . П пассажа

600 ед/мл.

Пример 3. Приготовляют на косом агаре культуру Asp. awamori на среде, содержащей вес. 4: раствори- . мого крахмала 10, 8 Бал ячменное сусло, агар-агар 2. Культуру выращивают при тех же условиях температуры и вре мени, что и в примере 1. Затем полученную культуру засевают в количестве 90 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 20 Бал кукурузном сусле.

После 7 сут культивирования активо ность глюкоамилазы на 18 Бал кукурузном сусле состаытяет 350 ед/мл, на

20 Бал кукурузном сусле-- 400 ед/мл (дпя 27. концентрации растворимого крахмала в среде) и 400 ед/мл для

18 Бал кукурузного сусла 1ОЖ растворимого крахмала на косом агаре), (7 Ф

500 ед/мл для 20 Бал кукурузного сусла (103 растворимого крахмала на косом агаре).

Пример 4. Твердую питательную среду того же Состава, что в примере

1, увлажняют до 603 солевым раствором состава, вес. : азотнокислый натрий (NANO>) 0,9; двузамещенный фос,форнокислый аммоний (NHg)

КН РОА. 0,22, хлористый калий КС1

О,И, сернокислый, магний MgSOp 0,103 сернокислое железо закисное FeSOg

0,011 сернокислый марганец Мп5040,005, сернокислый кобальт СО504

0,004, сернокислый цинк 2nSOg 0,001

5 988

В связи с этим для увеличения спорообразования, а также активации конидиального материала, с целью уменьшения расхода культур, можно добавлять растворы солей при увлажнении твердых питательных сред. Приготовленный посевной материал засевают в производственную среду в количестве 0,00125-0,0053. Дозировку полученного активированного кониди- 10 ального посевного материала на высококонцентрированные среды необходимо проводить с учетом конкурентной борьбы за субстрат (т.е. концентрации среды по углероду) и с уче- !5 том природы атакуемости субстрата (различные по крахмалу субстраты), например, для различных штаммов Asp.

awamo r i в диапазоне от 25 до 100 тыс. конидий на 1 мл среды (18-20О Бал ку- щ . курузного сусла) и от 800 тыс. до

1 млн. конидий на 1 мл среды (1820 Бал пшеничного, ячменного, рисо-. вого, соевого, ржаного сусла), При соблюдении рекомендуемых условий 25 выращивания и дозировки посевного конидиального материала активность глюкоамилазы в культуральной жидкости на 6-7 сут роста составляет 300350 ед/мл культуральной жидкости для i пассажа 400-450 ед/мл культуральной жидкости; для второго пассажа 500-600 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 1. Питательную среду, 35 состоящую из 503 пшеничных отрубей и, 503 солодовых ростков, увлажняют до

603 водопроводной водой, засевают культурой гриба Asp. аиащог1 466> выращенной на агаризованной среде сле-40 дующего состава, 4: сахароза 2, азотнокислый натрий (NaNO ) 0,91, однозамещенный,фосфорнокислый калий (КН РО ) О, 1, магний сернокислый (MgSOg) 0,05; хлористый калий,(КС1)

0,05; сернокислое железо (FeSOQ

0,001, агар-агар 2 (при 22ОС в течение 14 дней).

Засеянную культуру выращивают 6 дней при 30 С в термостате, а затем выращивают при 20 С также 6 дней. После выращивания осуществляют селекцию культуры на этой же среде при тех же параметрах температуры и времени. И получают I и 11 пассажи культуры пере55 севом выращенной культуры на 1 пассаж и 1 пассажа на П пассаж. яктивность глюкоамилазы готовых посевных культур составляет 115 ед/r ..

9888 сернокислая медь CuSO< 0,004, вода остальное, Получают конидиальный материал с активностью 150 ед ГлА/г сухой культуры. Затем его высевают в количестве 78 тыс. конидий на 1 мл питательной среды 18 Бал кукурузного сусла, На 7 сут роста получают культуральную жидкость с активностью

400 ед ГлА/мл культуральной жидкости, Пример 5. Питательную сре-, . !0 ду, состоящую из 703 ржаной муки, 303 солодовых ростков, увлажняют до

603 водопроводной водой, выращивают и рассевают на пассажи так же, как и в примере 1. Полученный посев.ной материал с активностью 205 ед/г сухой культуры засевают. в количестве 850 тыс. конидий на 1 мл питатель о ной среды на 18 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования по- щ лучают культуральную жидкость с активностью ГлА для l пассажа 300 ед/мл, П - 350 ед/мл, Ш - 400 ед/мл.

Пример 6. Питательную среду, состоящую из 70 ячменной муки zs и 303 солодовых ростков, увлажняют и рассевают так же, как в примере

1. Полученный посевной материал с активностью 200 ед/г сухой культуры засевают в количестве 900 тыс. кони- 30 дий на 1 мл питательной среды на кукурузное сусло 18 Бал. После 4 сут культивирования получают активность глюкоамилазы (ГлА) для: 1 пассажа

350 ед/мл, ll - 400 ед/мл, Ш - 430 ед/мл.

Пример 7. Питательную среду, состоящую из 503 рисовой муки и 504 солодовых ростков, приготовляют, выращивание и рассев производят так же, как в примеРе 1. ПолУченный ко- 4 нидиальный материал с активностью

210 ед/г сухой культуры засевают в количестве 830 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 1 90Áàë кукурузное сусло. После 7 сут культивирова- 4 ния получают культуральную жидкость с активностью ГлА для: 1 пассажа

330 ед/мл, для ll - 400 ед/мл, для

Ш - 500 ед/мл.

Пример 8. Питательную среду„ состоящую из 503 маниоки и 501 солодовых ростков, приготовляют, вырашивание и рассев производят так же, как и в примере 1 Полученный посевной материал с активностью ГлА 200 ед/г сухой культуры засевают в количестве 900 тыс. конидий-на 1 мл питатель ° ной среды на !8 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования по67 8 лучают культуральную жидкость с акти вностью ГлА для 1 пассажа 320 ед/мл „ для П - 370 ед/мл, для Ш - 450 ед/мл.

Пример 9. Питательную среду, состоящую из 504 пшеничных отрубей и 503 солодовых ростков, засевают штаммом гриба Asp. awamor! 224-21 и рассевают так же, как в примере 1.

Полученный посевной материал с активностью 100 ед/г сухой культуры засевают в количестве 50 тыс, конидий на 1 мл питательной среды 18 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования получают культуральную жидкость с активностью ГлА для: 1 ,пассажа 80 ед/мл, для П - 150 ед/мл, для Ш - 200 ед/мл.

Согласно изобретению, получают спороносящую культуру от (2-4) ° 10

9 спор в 1 r воздушно-сухой культуры, но более активизированную, которая при дальнейшем культивировании в глу. бинных условиях на высококонцентрированных углеводных средах позволяет увеличить биосинтез глюкоамилазы . в 2-3 раза по сравнению с контролем (вегетативной культурой), Кроме того, упрощается технологическая схема подготовки посевного материала: исключается посев в маточники, обеспечивается микробиологическая стерильность процесса, сокращается на 1,5-2 сут время приготовления посевного материала, активность новых конидиальных культур при хранении при 20-25ОС не уменьшается в течение 1-1,5 лет, а для и ll пассажей повышается по сравнению с контролем, т.е. хранением культуры на косом агаре, уменьшается расход ко, нидиального посевного материала по сравнению с принятым ранее в 100 раз, а по сравнению с вегетативным в

200 раз.

Формула изобретения

1. Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Aspergiilus awamori, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающий посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода, солодовые ростки и необходимые минеральные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственСоставитель И,Привалова

Редактор Е.Лазуренко ТехредТ.Фанта Корректор С.Шекмар

Заказ 99 ираж 521 одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб.,- д. 4/5 лиал П П атент, г, Ужгород, ул, ро ктная, 9 9 .:ной питательной среде, о т л и ч аю щ и " с я тем, что, с, целью повышения активности посевного материала ,путем адаптации его к высококонцент рированным производственным углеводным питательным средам и сокращения расхода посевного материала, в качестве источника. углерода в твердых питательных средах используют 50903 пшеничных отрубей и 40-903 муки: кукурузной или ячменной, или рисовой, или ржаной, или маниоки, или соевой, а процесс выращивания продуцента ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддержи- вая его на первой стадии в течение

5.-6 дней равным 29-31ОС, а по достижении обильного спороношения тем пературу снижают до 20-24 С и осуществляют вторую стадию в течение

5-6 сут с последующей селекцией полученных на этой среде конидий в несколько пассажей, при этом в качестве производственной питательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 6.

2, Способпоп. 1, отличаЮ шийся тем, что при выращивании в качестве продуцента штамма

Aspergillus awamori 466 селекцию ведут в два пассажа при повышении активности от 100 ед ГлА/г сухой культуры на стадии выращивания до

300 ед ГлА/г сухой культуры после второго пассажа, 3, Способ по пп. 1 и 2, о т л ич à ю шийся тем, что увлажнение питательных сред осуществляют раствором следующих солей, вес.Ф: йайО 0,9-1; (ИН ) НРО, . 0,2-0,3;

KHiP04 0,22-0, 23; KC 1 О, 11-0,1 2;

MgSO4 0,103-0,104; FeSOg 0,011-0,015

МпЬОф О, 05-0, 06; CoSO @ 0,004-0, 005;

88867 10

2п50д. 0,001-0,002> CuS04 О, 004"

0,005, вода - остальное, 4. Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов Aspergillus awamo"

ri продуцирующих глюкоамилазу-, предусматривающий посев продуцента на питательную среду, содержащую источник углерода, выращивание проду-, 10 цента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде, отличающийся тем, что, с целью активации посевного матери1 ала путем адаптации его к высококонц ент ри рованы м по углероду пи та тел ьным средам, посев продуцента осу.ществляют на питательную среду, содержащую 2-153 растворимого крахмал ла, 1-23 агар-агара и 7-83 ячменного сусла, а процесс выращивания ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его ,на первой стадии в течение 5-6 дней равным 29-31 С, а по достижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут, при этом в качестве производственной питатель30 ной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 Б.

5. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю шийся тем, что засев посевного материала в производствен3S ную питательную среду осуществляют в количестве 0,00125-0,00Я к объему питательной среды.

Источники информации, принятые .во внимание при экспертизе

1. Грачева И.М, Технология ферментных препаратов. М,, 1979, с. 67-69.

2. Авторское свидетельство СССР

Н 668941, кл. С 12 N 9/34, 1977 (прототип),

Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида aspergillus аuтамоri, продуцирующих глюкоамилазу (его варианты)

Похожие патенты: