Способ получения сорбента для хроматографической очистки ферментов

 

Сееэ Советсинх

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<щ99 7794 (61)Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 06.07,77 (2т) 2505893/23-26 с присоединением заявки ¹

f$g)М Кп 3

В 01 J 20/10

С 12 N 9/00

Государственный комитет

СССР, оо делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 230283. Бюллетень № 7

{$3) УДК 661. 183.

° 7(088.8) Дата опубликования описания 23.02.83

В.A.Òðîôèìîâ, A.П.Башкович, В.И.Яковлев, В.A

Л.И.Климова и О.М.Меркушев (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский технолог институт антибиотиков и ферментов медицинско назначения н Ленинградский ордена Трудового

-Знамени технологический институт им. Ленсове (71) Заявители

C (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТЛ ДЛЯ ХРОМЛТОГРАФИЧЕСКОЯ

ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способам получения неорганических сорбентов, в частности для хроматографической очистки ферментов, и может быть использовано в медицинской И.микробиологической проьишленностях.

Известен способ получения сорбента для выделения и очистки -биологически активных веществ, в частности альдегидосилохрома. В соответствии с известным способом силохром (с-1, с-2, с-3) смешивают с хлористым тионилом н кипятят. Высушенный хлорированный силохром заливают раствором 3,3-диметоксипропиленмагнийхлоридом в тетрагидрофуране, полученный альдегидосилохром промывают и сушат.

При пропускании через полученный сорбент раствора белка при 4-6 С изменение концентрации белка ripe.кращается приблизительно через

2 ч 513..

Известен также способ получения сорбента для связывания ферментов, включающий обработку пористой основы иэ группы, включающей стекло, силикагель, коллоидный кремнезем, окись алюминия силаном или его про- изводными в виде 0,1-104-ных раст,воров в толуоле, бензоле, ксилоле.

Связывание фермента протекает в течение 1-16 ч 2).

Недостатком известных способов является значительная инактивация ферменУа, низкий выход белка на стадии десорбции.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и доститт) гаемому результату является способ получения сорбента для очистки ферментов, включающий обработку силикагеля марки КСК-З,О раствором азотнокислого кобальта в аммиачном буферном растворе, содержащем хлористый аммоний и амьвтак (отношение Т:Ж=

1:100) при рН 8. При выдержввании раствора в контакте с силикагелем в течение 24 ч получают продукт с соотношением Co0: 8102=1: 1, 1 13 ).

Недостатками способа являются невысокие степень очистки и выход фермента на стадии десорбции за счет недостаточной избирательности сорбций в отношении к ферментам, в частности протеолитического гигролитина.

Целью изобретения является повышение степени очистки и выхода ферЗо мента

997794

Выход по активности, Ъ

Образец сорбента

Выход по белку

Элюент (0,5 И

NaCR в

0,001 м

СаСЕ2) Степень очистки циклы

Исходный раствор гигролити на

Способ удельная активность злюата, ПЕ/мг белка удельная

y,êòèâность

ПЕ/мг белка

Известный Силохром

С-80

Силикагель

КСК-Со

22,0

5,2

8,12

4,74

6,50

6,45

Предло- Силохром женный С-80-Ca-Pd-В1Ч

2,0

100

135

13,9

7,0

Силохром !

С-80-Ca-Pd-RiV

0,1 н НС

100

8,0

164

32,0

4,0

Поставленная цель достигается способом, включающим обработку крем- яийсодержащего соединения раствором неорганической соли в присутствии аммиачного раствора комплексообразователя,в качестве кремнийсодержащего сорбента используют силохром

С-80, в качестве соли — хлорид кальция, в качестве комплексообразователя — координационное соединение палладия с риванолом и обработку 10 растворами соли и координационного .соединения ведут при рН 10-11.

Полученный сорбент обрабатывают

0,1. н соляной кислотой.

Способ осуществляют следующим образом.

Силохром С-80 обрабатывают раствором хлористого кальция при рН 10-11, выдерживают в течение нескольких часов, затем промывают водой и су»» шат., 20

Готовят аммиачный раствор коор« динационного комплекса палладия с риванолом> и в полученный раствор вносят силохром С-80, обработанный хлористым кальцием, полученный сорбент отфильтровывают, промывают водой и сушат. Высушенный сорбент об.рабатывают соляной кислотой.

Из таблицы следует, что сорбент

;по предложенному способу резко

;превышает известные по степени очист- 5

Пример, 10 r силохрома С" 80 обрабатывают 200 мл 10%-ного раствора хлористого кальция при рН 10,5 (pH раствора создают 0,1 í Na0H) и выдерживают при перемешивании на . качалке в течение 10 ч. Затем силохром промывают дистиллированной водой до нейтральных промывных вод и сушат при t 105 С. Обрабатывают силохром С-80, активированный ионами кальция, координационным соединением палладия с риванолом.

60 мг комплекса палладия с риванолом растворяют в 200 мл дистиллированной. воды и доводят рН раствора до 10,5 аммиаком. Затем в полученный раствор вносят 10 г силохрома С-80, активированного ионами кальция. Смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании 10 ч. Затем сорбент отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции и сушат при

105 С. Высушенный сорбент загружают в колонку и обрабатывают 50 мл

0,1 н соляной кислотой. Затем сорбент отмывают дистиллированной водой до нейтральных промывных вод.

Результаты использования полученного сорбента приведены в таблице. ки и по выходу по активности фермента. Возможно, в данном случае ион металла, связанный с риванолом, 997794

Составитель В.Виноградова

Редактор С.Лыжова Техред. Е.Харитончик Корректор С.Шекмар

Заказ 996/9 Тираж 535 Подписное

ВНИИПИ Государственного .комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, москва, Ж-35, Раушская, наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент ., г. Ужгород, ул. Проектная, 4 оказывает на активный,ферментный

-белок специфическое действие, в результате которого меняется конформация белка, что приводит к уве.личению его активности. При этом ионы тяжелых металлов, являющиеся ингибиторами .ферментов, выступают в данном случае s роли активаторов.

Исследование поверхностных свойств образцов союбентов, приве;денных в таблице, показало, что удельная поверхность в результате проведенных модификаций остается постоянной и равной удельной aosepx» ности силохрома С-80. Измерения электрокинетического потенциала, т.е. заряда поверхности полученных образцов, показали, что все модифицированные образцы сорбентов заряжены отрицательно, однако значения электрокинетического потенциала силохрома С- 80, насыщенного ионами кальция, модифицированного координационным соединением палладия с риванолом и обработанного соляной кислотой, достигли наибольшего значения по абсолютной величине, pasного 3,79 мВ, что на порядок превышает значение электрокинетического. потенциала сорбентов, полученных известным способом..

Формула изобретения

1. Способ получения сорбента для хроматографической очистки фермеитов путем обработки кремнийсодержащего соединения раствором неоргани- ческой соли в присутствии аммиачного раствора комплексообразователя, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки и выхода фермента, преимущественно протеолитического фермента - гнгролитииа, в качестве кремнийсодержа» щего сорбента берут силохром С»80, в качестве соли - хлорид кальция, в качестве комплексообраэователякоординационное соединение цалладия с риванолом и обработку растворами соли и координационного соединения ведут при РН 10-11 °

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью дополнительного повышения степени очистки и выхода фермента, полученный

20 сорбент обрабатывают 0,1 н соляной кислотой.

Источники информации,. принятые во внимание при экспертизе

l. Биоорганическая химия., 1976, т.2, 9 5, с.700.

2. Патент США В 3519538, кл. 196-63, 1970.

3. Авторское свидетельство СССР

В 361979, кл. С 01- В 33/28, 01.12..69 . (прототип) .