Патенты автора Колесников Александр Владимирович (RU)
Предложен способ получения рекомбинантного экзопротеина А P. aeruginosa (rEPA). Способ включает получение экспрессионного плазмидного вектора pET-rEPA (SEQ NO: 3), содержащего промоторную последовательность ДНК бактериофага Т7 и последовательности ДНК, кодирующие N-концевую область белкового продукта энхансера трансляции (аминокислотная последовательность MASMT), шесть остатков гистидина, сайт расщепления протеазой SUMO и оптимизированную для трансляции в Е. coli последовательность (SEQ NO: 1), кодирующую рекомбинантный белок rEPA (SEQ NO: 2). Осуществляют продукцию рекомбинантного химерного белка-предшественника в гетерологичной системе экспрессии в электрокомпетентных клетках Е. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидным вектором pET-rEPA с получением штамма Е. coli BL-rEPA, при 37°С для обеспечения накопления максимального количества белка-предшественника в растворимой фракции. Проводят лизис бактериальной массы в присутствии 4% Triton Х-100 для сохранения белка-предшественника в растворимой форме. Выделяют белок предшественник с помощью металл-хелатной хроматографии на сорбенте Talon, заряженном ионами Со2+, с последующим отщеплением гексагистидина и пептида SUMO протеазой SUMO из состава полипептида. Отщепленный рекомбинантный белок rEPA доочищают анионообменной хроматографией на сорбенте DEAE-Sepharose и гель-фильтрационной хроматографией на колонке, заполненной Superdex 200, с переводом в конечный буфер со значением рН 7.5, с получением рекомбинантного белка rEPA. Изобретение обеспечивает получение белка с высоким выходом, составляющим 0,25 г с литра бактериальной культуры. 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и биофармакологии. Предложен способ получения рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) Legionella pneumophila. Конструируют плазмиду pET22b(+)-PAL длиной 6184 п.н., несущую экспрессионную конструкцию для продукции химерного полипептида, содержащего последовательность, кодирующую белок PAL, слитую на 5’-конце с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов и пептид SUMO. Трансформируют клетки Е. coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pET22b(+)-PAL. Культивируют полученный штамм BL21(DE3)-PAL при 37°C с продуцированием белка PAL в течение 3 ч. Очищают белок HIS-SUMO-PAL из растворимой фракции бактериального лизата металл-хелатной хроматографией. Отщепляют пептид HIS-SUMO обработкой SUMO-протеазой с восстановлением нативной структуры белка PAL. С помощью ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии получают гомогенный препарат белка PAL. Изобретение обеспечивает получение белка PAL, обладающего 98% чистоты по данным электрофореза и денситометрии, с выходом не менее 300 мг с литра бактериальной культуры без ферментации, который может быть использован при разработке диагностических препаратов для определения легионеллезов. 5 ил., 3 пр.
Настоящее изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения слитого химерного рекомбинантного белка fliC:pagN. Для осуществления способа конструируют рекомбинантную плазмиду pETfliCpagN, затем трансформируют клетки Escherichia coli BL21(DE3) указанной плазмидой и культивируют полученный штамм BL-fliCpagN при температуре 37°С. Затем получают периплазматическую фракцию бактерий-продуцентов обработкой клеток лизоцимом в 20% растворе сахарозы с последующим центрифугированием, проводят очистку химерного белка fliC:pagN металл-хелатной, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографией с получением гомогенного конечного препарата белка fliC:pagN. Рекомбинантная плазмида pETfliCpagN содержит промотор бактериофага Т7 и несёт последовательности, кодирующие белки fliC, включая лидерную последовательность данного белка, и pagN S.typhimurium, объединенные короткой линкерной последовательностью GSVDSSSGGN, и слитые на 3'-конце с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов. Заявленный способ получения fliC:pagN позволяет синтезировать данный белок в растворимой форме с нативной N-концевой аминокислотной последовательностью, а также с выходом не менее 0,3 г белка с литра бактериальной культуры, обладающего 98% чистоты. 7 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа направленного истощения олигонуклеотидных библиотек в отношении водорастворимых белковых мишеней глутатион-S-трансферазы и стрептавидина. Представленный способ включает подготовку комбинаторной олигонуклеотидной библиотеки в количестве 1015 молекул к отбору, разведение олигонуклеотидов библиотеки до концентрации 1015 молекул на 1 мл, денатурацию олигонуклеотидов при 90°С в течение 10 минут и отжиг олигонуклеотидов при 37°С. Связывание глутатион-S-трансферазы или стрептавидина в количестве 1 мг с подготовленным пулом исходной олигонуклеотидной библиотеки в буферном растворе, содержащем 20 мМ Tris-HCl рН 7,4, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, и разделение полученной смеси нуклеиновая кислота/белок-мишень гель-фильтрационной хроматографией на фракции. Изобретение позволяет элиминировать из пула олигонуклеотидов максимально возможное количество аффинных к заданной мишени молекул, а повторение раундов такой селекции гарантирует отсутствие в финальном пуле молекул олигонуклеотидов, имеющих значимую для дальнейшего применения аффинность к мишени. Изобретение может быть применено для получения выскоаффинных аптамеров, применимых в области биомедицины. 7 ил., 7 пр.
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантной фосфатазы бактериальных липополисахаридов. Данный способ включает синтез оптимизированной для трансляции в E. coli последовательности ДНК, кодирующей белок фосфатазы LpxE F. novicida. Указанная последовательность ДНК представлена на Фиг.1А. Настоящий способ предусматривает последующее конструирование экспрессионного вектора, кодирующего химерный белок-предшественник с N-концевой химеризацией. Указанный белок-предшественник состоит из последовательности мальтоза-связывающего белка, сайта узнавания протеазой фактором Xa, шести гистидинов и фосфатазы LpxE F. novicida. Способ также предполагает получение рекомбинантного белка-предшественника продукцией в E. coli и его выделение и очистку. Указанный способ предусматривает последующее выщепление мальтоза-связывающего белка из состава полипептида и доочистку белка фосфатазы LpxE. Настоящее изобретение позволяет получать рекомбинантную фосфатазу LpxE F. novicida с высоким выходом. 6 ил., 5 пр.
ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)Gold/pETCYPopti - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЦИКЛОФИЛИНА А ЧЕЛОВЕКА // 2603283
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму Escherichia coli BL21(DE3)GoldpETCYPopti. Настоящий штамм является продуцентом рекомбинантного циклофилина А человека. Штамм получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3)Gold плазмидой pETCYPopti. Указанная плазмида имеет размер 5858 пар нуклеотидов и содержит фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), несущего ген устойчивости к ампициллину ampR, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7 и полилинкер, в котором по сайтам XhoI-NdeI клонирован фрагмент, несущий ген рекомбинантного циклофилина А человека размером 498 пар нуклеотидов, SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение позволяет получать циклофилин А человека с высоким выходом и чистотой. 3 ил., 1 пр.
ВЗРЫВАТЕЛЬ БОЕПРИПАСА МНОГОРЕЖИМНЫЙ // 2595109
Изобретение относится к многорежимным взрывателям боеприпаса, изготовленным с применением микроэлектромеханических структур и элементов. Взрыватель боеприпаса содержит боевую часть с боеприпасом, спецвычислитель, блок питания, соединенный с спецвычислителем, блок задания режимов. Последний включает систему предохранения с системой прерывания выполнения боевой задачи. Взрыватель также содержит механизм дальнего взведения, систему самоликвидации, пусковой исполнительный механизм, ключи. Взрыватель дополнительно содержит антенну, приемник глобальной позиционной системы, бесплатформенную инерциальную систему и резервный блок питания. При этом выход антенны через приемник глобальной позиционной системы соединен с входом бесплатформенной инерциальной системы. Выход последней соединен с входом спецвычислителя. Выход спецвычислителя соединен с входом резервного блока питания. Первый выход резервного блока питания соединен с системой предохранения. Второй выход резервного блока питания соединен со входами механизма дальнего взведения и системы самоликвидации. Выход системы предохранения через первый ключ соединен с первым входом пускового исполнительного механизма. Выход механизма дальнего взведения через второй ключ соединен с вторым входом пускового исполнительного механизма. Выход системы самоликвидации соединен непосредственно с третьим входом пускового исполнительного механизма. При этом введенные антенна, приемник глобальной позиционной системы, бесплатформенная инерциальная система и блок задания режимов выполнены в виде микроэлектромеханических систем, расположенных над боевой частью в корпусе взрывателя. 3 ил.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамера, которая связывается с протеолитической субъединицей нейротоксина типа A Clostridium botulinum. Данная последовательность ДНК-аптамера состоит из одноцепочечной ДНК длиной 81 нуклеотид, выбранной из группы: APT/LCBONTA N10, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACCCTCCACTTTTGACGGCTTCCTCGGGATTATACGGCTA ACCGAGGGTGAGATGTACAGACTAG, или APT/LCBONTA N16, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACTCTGCTGGGATGGCCTAGCAGCCGATTATTGG GCTAAGCGGGCGTGTGAGATGTACAGACTAG. Данная последовательность ДНК-аптамера обладает высокой специфичностью в отношении протеолитической субъединицы (легкой цепи) токсина типа A Clostridium botulinum с константами аффинности соответственно 1,2·109 М-1, 1,3·109 М-1. Изобретение позволяет ингибировать протеолитическую активность легкой цепи BoNT/A с высокой эффективностью. 10 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биохимии. Заявлен штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1G7 - продуцент моноклональных антител к ботулиническому токсину типа В. Штамм депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур федерального бюджетного учреждения науки государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ), коллекционный номер - Н-46. Изобретение позволяет получить высокоспецифичные моноклональные антитела к ботулиническому нейротоксину типа В, пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя ботулизма. 6 ил., 2 табл., 8 пр.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия в биологических жидкостях, окружающей среде и продуктах питания бактерий Escherichia coli штамма O157:Н7, включающий дезинтеграцию бактерий ферментативной обработкой и лизис неионным детергентом, адсорбцию на парамагнитных частицах при помощи специфического моноклонального антитела, детекцию антигена бактерий Е.coli O157:Н7 при помощи специфического биотинилированного моноклонального антитела, связывание полученного комплекса с нековалентным коньюгатом ДНК-матрицы с нейтравидином, диссоциацию твердофазного комплекса "антитело-антиген Е.coli O157:Н7 - биотинилированное антитело-коньюгат" добавлением раствора глицин - HCl рН 2.6, ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы и выявление наличия бактерий Е.coli O157:Н7 по скорости нарастания флуоресцентного сигнала. Данный способ отличается высокой специфичностью и чувствительностью детекции и может быть использован в ранней диагностике геморрагического колита и санитарно-гигиеническом контроле над наличием его возбудителя. 5 ил., 8 пр.
Изобретение относится к области биохимии. Заявлен штамм гибридных клеток животных Mus. musculus 3F11 - продуцент моноклональных антител к ботулиническому токсину типа В. Штамм депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур федерального бюджетного учреждения науки государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ), коллекционный номер - Н-45. Изобретение позволяет получить высокоспецифичные моноклональные антитела к ботулиническому нейротоксину типа В, пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя ботулизма. 6 ил., 2 табл., 8 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамеров. Указанный ДНК-аптамер связывается с шига-токсином типа 2 и представляет собой одноцепочечную ДНК AptStx2B17 длиной 81 нуклеотид и молекулярной массой 27 кДа. ДНК-аптамер специфически связывает В-субъединицу шига-подобного токсина 2 с константой связывания 1,7·109 М-1 и первичной последовательностью CATACGTTCGACTGCTACCTTAGCCTGGTCTTATGATGCCTGTTTGATCCTGATGGCTAATATGTGAGATGTACAGACTAG. Последовательность ДНК-аптамера отобрана в результате раундов позитивной селекции в отношении рекомбинантного белка В-субъединицы шига-токсина типа 2 на основе системы магносепарации с отделением белка-мишени, аффинно связанного со специфичными аптамерами, из состава химерного полипептида посредством расщепления химерного конструкта по сайту, содержащему субстрат протеазы летального фактора. ДНК-аптамер способен специфически детектировать В-субъединицу шига-подобного токсина 2 по методу ПЦР в режиме реального времени в концентрации до 10-11 г и нейтрализовать его активность по отношению к клеткам перевиваемой линии Vero в концентрации ID50=3 мкМ. Изобретение позволяет с высокой эффективностью детектировать В-субъединицу шига-токсина. 4 ил., 7 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамера. Указанный ДНК-аптамер связывается с бактериями Escherichia coli O157:Н7 и представлен одноцепочечной ДНК O157Flank длиной 81 нуклеотид и молекулярной массой 27 кДа. ДНК-аптамер обладает высокой специфичностью связывания в отношении бактерий Escherichia coli O157:Н7 и имеет первичную последовательность CATACGTTCGACTGCTACTCTGAGTCTGACCTTACAGTCAGTCAATCATGGGACAT ACGAAATGTGAGATGTACAGACTAG. Последовательность ДНК-аптамера отобрана в результате раундов позитивной селекции против бактерий Escherichia coli O157:Н7 и негативной селекции против бактерий других серогрупп Escherichia coli и близкородственных микроорганизмов с использованием тРНК в качестве молекулы-компетитора за связывание. ДНК-аптамер способен специфически детектировать бактерии Escherichia coli O157:H7 в реакции иммуноаптамерной ПЦР в концентрации до 103 микробных клеток на 1 мл раствора. Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью детектировать бактерии Е. coli O157:Н7. 3 ил., 2 табл., 6 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК, которую используют в качестве зонда для обеспечения максимального соотношения «сигнал/фон» в тест-системах на основе иммуно-ПЦР. Указанная последовательность ДНК имеет длину 81 нуклеотид и представляет собой последовательность CA-TAC-GTT-CGA-CTG-CTA-CTG-GTG-CAA-CGG-GTT-CGA-TCA-GCT-CCG-CCG-GGC-CTC-CCA-ATC-CCC-CGT-GAG-ATG-TAC-AGA-CTA-G и CA-TAC-GTT-CGA-CTG-CTA-CCG-AAT-GGA-TGT-GTC-CGA-GCT-CCA-TTT-CCG-TCC-AAT-CCT-CTT-CGT-CGT-GAG-ATG-TAC-AGA-CTA-G. Данная последовательность ДНК инертна по связыванию с бычьим сывороточным альбумином и α-казеином, являющимися наиболее часто используемыми инертными белками в составе блокирующих растворов, применяемых в иммуноанализе, несет молекулу биотина в крайнем 5'- положении для образования комплекса с биотинилированным детектирующим антителом посредством одновременного взаимодействия с белком авидинового ряда. Предложенное изобретение обеспечивает высокое отношение «сигнал/фон» при детекции белка-мишени по методу иммуно-ПЦР. 8 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для отбора аффинных молекул. Конструируют плазмидную ДНК pGST/APT/X длиной 6193 п. н., массой 4,09 МДа, содержащую в качестве генетического маркера ген β-лактамазы и уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: BgIII 665 п. н., BamHI 779 п. н., XhoI 801 п. н. Плазмида pGST/APT/X состоит из NdeI-XhoI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+) и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, встроенной по сайтам NdeI-XhoI и объединяющей в своем составе последовательности, кодирующие фрагмент гена глутатион-S-трансферазы, пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, пептид GGLNDIFEAQKIEWHED, биотинилирующийся in vivo под действием биотин-лигазы E.coli, и линкерную последовательность, заменяемую с помощью генно-инженерных манипуляций по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI на последовательность, кодирующую белок-мишень В-субъединицу шига-токсина I. Изобретение позволяет проводить отбор высокоспецифических аптамеров к данному белку-мишени. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения наличия ботулинического нейротоксина типа А (BoNT/A). На парамагнитных частицах, несущих иммобилизованный белок G бактерий семейства Streptococcus, с блокированными раствором Денхардт-ДНК адсорбируют белок BoNT/A при помощи специфических высокоаффинных поликлональных антител. Детектируют образование комплекса белка BoNT/A с биотинилированным антителом посредством нековалентного коньюгата фрагментов ДНК с нейтравидином. Проводят ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени. Регистрацию присутствия BoNT/A в исследуемых образцах проводят по изменению уровня флуоресценции против контрольных. Изобретение обеспечивает эффективный способ определения наличия BoNT/A в пробах биологических жидкостей и тканей при первичной и вторичной интоксикации, а также в продуктах питания и может быть использовано для анализа как инфекционно опасных, так и инактивированных образцов. 5 ил., 1 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок. Способ позволяет определить неспецифическую устойчивость патогенных микроорганизмов к антибиотикам и установить факт присутствия бактериальных биопленок. 4 ил., 5 пр.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу специфического отбора высокоаффинных молекул ДНК (ДНК-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени. Указанный способ включает синтез единой полипептидной цепи рекомбинантного белка, содержащего в своем составе фрагмент глютатион-S-трансферазы, целевой белок-мишень, пептидную последовательность, расщепляемую летальным фактором B. anthracis, и пептид, биотинилирующийся in vivo под действием фермента биотин-лигазы E.coli, связывание полученного рекомбинантного полипептида с библиотекой олигонуклеотидов и иммобилизацию белка на парамагнитных частицах, несущих глютатион, промывку парамагнитных частиц с иммобилизованным полипептидом от несвязавшихся олигонуклеотидов в потоке жидкости, отщепление белка-мишени со связанными ДНК-аптамерами с поверхности парамагнитных частиц летальным фактором B. anthracis, выделение и амплификацию аффинной к рекомбинантному белку-мишени последовательности ДНК в полимеразной цепной реакции и получение набора одноцепочечных ДНК-аптамеров, специфичных к белку-мишени. Изобретение позволяет эффективно получать высокоаффинные специфичные ДНК-аптамеры к рекомбинантным белкам-мишеням. 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде
СПОСОБ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ // 2478970
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, конкретно к областям диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем для иммунофлуоресцентного определения протективного антигена (ПА) возбудителя сибирской язвы в образцах биологического происхождения
Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской биохимии, диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработке диагностических тест-систем
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ИНФЕКЦИИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ // 2418860
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям биомедицины, биоскрининга и разработки способов диагностики на основе искусственных репортерных биомолекул, касается нового способа высокочувствительной детекции каталитически активного белка летального фактора сибирской язвы LF; способа амплификации сигнала, образуемого при расщеплении субстрата низкоэффективным протеолитическим ферментом
Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области генной инженерии, касается способа получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы LF, рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТНIS-LF, кодирующей активный белок летального фактора сибирской язвы LF, и штамма бактерий Escherichia coli, продуцирующего активный белок летального фактора сибирской язвы
