Способ получения альдолазы из скелетной мышцы человека

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬДОЛАЗЫ ИЗ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ ЧЕЛОВЕКА путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония, отделения баилластных белков с последукщей кристаллизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, экстракцию пробы проводят двузамещенным раствором KiHP04 в соотношении 1:2 в течение 60 - 80 мин, далее экстракт отделяют от плотной части, добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,45 по объему, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 30 мин, к полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55, снова центрифугирую при 12000 об/мин в течение 10 - 15 мин, осадок растворяют в 0,03 М раствора , добавляют сульфат аммония до рН 6,0 - 6,2 и кристаллизацию целевого продукта ведут на холоде.

COOS СОВЕТСКИХ

»иц

РЕСПУБЛИК (19) (11) (д) 4 А 61 К 35/34

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ HSOEiPETEHHA И ОТКРЫТИИ

ВСЕСОЮЗНАЯ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . 3;",.,,:,,И

К ABTOPGKOMV СВИДЕТЕЛЬСТБУ яилиотиы (21) 2961074/28-13 (22) 25.07.80 (46) 30.09.87. Бюл. 11 36 (71) Куйбьппевский медицинский институт им. Д.И.Ульянова (72) Ф.Н.Гильмиярова, Н.Н.Постникова и Л.А.Анохина(53) 616.07(088.8) (56) Гулый М.Ф., Дворжикова П.Д., Коломийченко М.А., Понадюк Е.Я. Метод фракционирования и кристаллиэа».: ции мьппечных белков. Вопросы биохимии мышц. Киев, 1954, 244-258.

А.Dsugy И.Mnuk and Т.Baranows1ñå

"Purification and properties of

human Nuscle Aldolase" Alta Biochinuca polinica" Л 3, 1974, 21 р.237245. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬДОЛАЗЫ

ИЗ СКЕЛЕТНОИ МЫШЦЫ ЧЕЛОВЕКА путем раэмельчения ткани. экстрагировання раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония, отделения балластных белков с последующей кристаллизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, экстракцию пробы проводят двузамещенным раствором К НР04 в соотношении

1:2 в течение 60 — 80 мин, далее экстракт отделяют от плотной части, добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,45 по объему, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20—

30 мин, к полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до насыщения. 0,55, снова центрифугирую1 при е

12000 об/мин в течение 10 — 15 мин, осадок растворяют в 0,03 М раствора р

К НРО, добавляют сульфат аммония до 1ав рН 6,0 — 6,2 и кристаллизацию целевого продукта ведут на холоде.

1022

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в энзимологии и в медицине для изучения заболеваний на молекулярном уровне.

1с

Известен способ получения альдолазы методом фракционного осаждения сульфатом аммония из скелетной мышцы кролика.

Однако, этот способ выделения фер- >1> мента не позволяет получить альдолазу в кристаллически чистом виде из мышцы человека.

Известен также способ получения альдолазы из скелетной мышцы человека путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония, отделения балластных белков с последующей кристаллизацией целевого продукта.

Однако известный способ длителен.

Целью изобретения является ускорение способа.

Для достижения этой цели при осуществлении способа получения альдолазы из скелетной мышцы человека путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммо- ЗО ния, отделения балластных белков с последующей кристаллизацией целевого продукта, отличительной особенностью является то, что зкстракцию пробы проводят двузамещенным раствором

К НРО» в соотношении 1:2 в течение

60 — 80 мин, далее, экстракт отделяют от плотной части, добавляют сульфат аммония до степени насыщения

0,45 по объему, центрифугируют при рб

6000 об/мин в течение 20-30 мин, к полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55, снова центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10-15 мин, осадок раство- 41; ряют в 0,03 М растворе К НРО», добавляют сульфат аммония до рН 6,0 — 6,2 и кристаллизацию целевого продукта ведут на холоде.

Способ осуществляют следующим об- у1 разом.

I э т а и. Для выделения альдолазы берут 500 г мышечной ткани с бедра умершего, с момента смерти которого прошло не более 24 ч. Мышцы хорошо охлаждают с помощью льда, очищают от жировой, соединительной ткани, пропускают дважды через охлажденную мясорубку. Полученный фарш

542 2 взвешивают и смешивают с двукратным объемом охлажденного раствора 0,03 М

К НРО„. Экстрагируют 60 мин при периодическом помешивании стеклянной палочкой при температуре 2 С. Через

60 мин экстракции плотный остаток мышц отжимают через ткань, отбрасывают. Измеряют объем экстракта.

К полученному экстракту добавляют растертый порошок сульфата аммония из расчета 32,4 г на каждые 100 мл, что составляет 0,45 насыщения. Порошок сульфата аммония добавляют небольшими порциями, медленно перемешивают, не взбивая пены. После полного растворения сульфата аммония через 15 мин стояния на холоде образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин или фильтрованием через складчатый фильтр.

II э т а п. К прозрачному центрифугату или фильтрату добавляют еще сульфат аммония из расчета 7,2 г на

100 мл, повышая тем самым насыщение до 0,55 (фракц. 0,55). При помешивании стеклянной палочкой растворяют добавленную соль и через 15 мин сто-. яния на холоде центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при

10000 об/мин в течение 15 мин. Центрифугат отбрасывают. Плотный осадок, содержащий значительное количество альдолазы, собирают. В хорошо охлажденные пробирки к осадку, полученному из 500 г мьппц, прибавляют 1520 мл 0,03 M К» НРО». Первой порцией растворяют осадок в первой пробирке.

Растворив, переливают во вторую пробирку и т.д. Второй порцией омывают белок в каждой пробирке и объединяют растворы в последней, перемешивая стеклянной палочкой. При растворении осадка указанным объемом 0,03 M раствором К НРО» раствор может быть прозрачным или слегка ополесцировать.

Такой раствор пропускают через ватный фильтр, смоченный 0,03 М раствором К» НРО». Это позволяет избавиться от пузырьков воздуха и загрязнений.

K полученному раствору добавляют мелкодисперсный сульфат аммония, тщательно перемешивая, до появления слегка заметной мути, дающей при перемешивании стеклянной палочкой шелковистость. Использование 0,03 М раствора К НРО„ для растворения осадРедактор Н.Сильнягина Техред И.Попович Корректор A.Тяскц".

Заказ 4451 Тирах 594 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4

3 10 ка и последующее добавление сульфата аммония приводит к получению рН маточного раствора 6,0-6,2„ при котором и происходит кристаллизаПия альдолазы, рН раствора проверяют потенциометрически.

Если в результате фильтрования, через ватный фильтр, предварительно смоченный бидистиллированной водой, раствор становится прозрачным, то насыщение следует повышать, прибавляя небольшими порциями сернокислый аммоний до появления шелковистости при медленном помешивании стеклянной палочкой. Оставляют в холодильнике для кристаллизации при температуре

3 С.

Кристаллы альдолазы в виде гексагональных бипирамид появляются через

6 сут. без внесения затравки. При добавлении же затравки кристаллизация начинается через 12 ч. Процесс кристаллизации заканчивается на 9 сут.

III э т а п. Перекристаллиэация альдолазы. Осадок первичных кристаллов отделяют центрифугированием в . рефрижераторной центрифуге при

10 000 — 12 000 об/мин в течение

6 мин. Осадок растворяют в минимальном количестве 0,03 М раствора К НР04 под контролем с помощью микроскопа.

Раствор пропускают через смоченный

0,08 М раствором К НР04. ватный

22542 фильтр, освобождаясь тем самым от воздуха. Затем добавляют мелкодисперсный порошок сульфата аммония до появ5 ления слабой мути и шелковистости при медленном помешивании стеклянной па-. точкой. рН маточного раствора, при котором начинается кристаллизация, составляет 6,3. Кристаллизация может

10 протекать как при комнатной температуре, так и при стоянии на холоде.

Первые кристаллы появляются через сутки.

Активность фермента возрастает

15 при перекристаллизации. Перекристаллизация обеспечивает получение гомогенных препаратов альдолазы, позволяет освободиться от миоглобина, дегидрогеназ и (ругих ферментов.

Способ получения иэ ткани человека индивидуально чистого препарата альдолазы — одного из ведущих ферментов углеводного обмена, расширяет возможности в теоритической энзимологии, а именно, могут быть охарактеризованы физико-химические свойства, структурно-функциональные особенности энэима из мышц человека, про30 слежены закономерности конформационной организации и каталитической функции и филогенезе, а в медицине-возможность изучения заболеваний на молекулярном уровне.