Способ определения активности фенолоксидаз

 

I. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВЬЮСТИ ФЕЖ)ЛОКСИДАЗ, включаюЩЙ1 обработку пробы фенольвым субстратом и измерение люминесценции реакционней смеси, отличающийся тем, что, с целью расширения класса определяемых фенолокспдаз, обработку пробы субстратом ведут в присутствии суспенаии светящихся бактерий Б&иесКеа . 2. Способ по п. t, отличающий с я тем, что, обработку пробы субстратом вeдJт при рН 6-8.

СОЮЗ ССВЕТСННХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

„Я0„„102 208 А <50 С g2g 1/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ, l

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТБЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21,) 3324329/28 13 (22) 21,05,81. (46) 07,07,83, Бюл, yg ".« 5 (72) Е, Ф. Гаврилова, А, Э. Балаян, Д, H. Стом и В. A Иванов (71) Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете им, А. А. Жданова (53) 577.15(088.8) (56) 1. Дс+о СЪее Бсцид., 3.967, 21, 2367-2378, 2. Авторское свидетельство СССР

Иу 706771, кл. 601 É 33/54, 1978, (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АК ГИВНОСТИ ФЕНОЛОКСИДАЗ, включающий обработку пробы фенольным субстратом и измерение люминесценции реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью расширения класса определяемых фенолоксидаз, обработку пробы субстратом ведут в присутствии суспензия светящихся бактерий ВеиесКеа ОГО ЕЧ1.

2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, обработку пробы субстратом ведут при рН 6-8.

1027208 низкая чувствительность и невозможность измерения в мутных растворах.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ определения активности полифенолоксидазы путем обработки исследуемой пробы фенольным субстратом — экскулетином и измерения люминесценции. Обычно обработку пробы ведут при рН 6,8-8,0.

Способ основан на использовании люминесцпрующего субстрата-эскулетина и спектра 5 его,поминсценции. Активность при атом характеризуется величиной снижения интенсивности свечения при 465-480 нм в интервале 5-10 мин при воздействии мг ферментного препарата (2).

Недостатком известного спОсоба явB табл. 1 дана интенсивность свече55 ния бактерий в присутствии фенолов и после введения фермента, В табл. 2 показана активность фенолоксидаз (Ь ма за 2-З с 1 мг ферменте) Изобретение относится к аналитической химж, в частности к способам опре-. деле цм активности фенолоксидазных ферментов, и может быть использовано в лабораторной практике, медицине, пищевой промышленности, Известен способ определения активности фенолоксидаз путем обработки исследуемой пробь1 субстратом и спектрофотометрирования, Активность выражается в увеличении поглощения при длинах волн, соответствующих продуктам окисления (Ц, Недостатком этого способа являются ляется то, что он пригоден для определелеппя только одного фермента.

I <еель изобретения — расширение класса о- ре.,еляемых фенолоксидаз. 35

Указанная цель достигается тем, -. о согласно способу определения актив:.ости. фенолоксидаз, включающему обработку анализируемой пробы фенольным

".óáñòðàòîì и измерение люминесценции 40 реакционной смеси, обработку пробы субстраток: ведут в присутствии суспензия светящихся бактерий ЭВЕРС 1 80 !

r,u its i

Кроме того, обработку пробы субстра-- 45 том обычно веду| при рН 6-8е

Способ осуществляется следующим образом„

B суспенжпо светящихся бактерий ,ЕneС1;рс narveyi вводят исследуемуо фенолокспдазу (-дифенолоксидазу или о-дифенолоксидазу) и ее субстрат

/,,,!" — Или О-дифенол). Через 2-З с после введения по шкале гальванометра

М-95, соединенного с фотоэлектронным ",ножителем (ФЗУ-79), регистрируют снижение свечечия бактерий за счет пнгибирования их хиноидными прод 7ктами ферментативного окисления. Отмечаемое гашение интенсивности свечения служит мерой активности фермента.

Интенсивность свечения бактерий принимают за 100 ма. За единицу фенолоксидазной активности принято изменение интенсивности свечения бактерий (в процентах) одним мг белкого препарата за

2-3 с.

Короткий период проявления реакции (2-3 с) позволяет определять начальную активность фенолоксидаз < сохраняющихся в нативном виде, что невозможно при более длительных периодах определения из-аа изменения фенолоксидаз под действием образующихся хинонов, что позволяет сделать более строгое заключение о феполоксидазной активности различных белковых препаратов, Предлагаемый способ позволяет расширить класс определяемых фенолоксидазных ферментов, так как в отличие От известного в качестве субстрата можно использовать не только экскулетин но и пирокатехин и гидрохинон, которые являются значительно более универсальными субстратамп для окисления значительно большюл числом фенолоксидазных препаратов.

Способ позволяет также расширить область рН, в которой возможно определение фенолоксидазной активности, что дает возможность увеличить количество определяемых фенолоксидаз за счет ферментов, имеющих максимум активности при рН 6-6,5.

По сравнению(с известным способом определяется интенсивность свечения не самого субстрата, а постоянного биологического объекта, чувствительного к хинону.

Пример, В термостатируемую камеру установки, состоящей из ФЭУ-79 и гальванометра М-95 помешают стеклянную кювету с 1 мл суспензии клеток ВЕи8 сМрд 4gryqyi концентрации

500- 10 клеток/мл и о,1 мл раствора

6 фенола в фосфатном буфере. B кювету при перемешивании вводят 0,1 мл раствора фермента cконцентрацией 1 г на 100мл буфера. По шкале гальванометра в течение 2-Э с после введения фермента фиксируют изменение интенсивности свечения.

1027208

Табл

1 10

80,5

25,5

80,8

37,7

23,2

1. 10

100 аблица 2

1 10

5. 10

57,6

1 --10

Таблица3

6,0

7,2

8,0

53,5

8,5

ВНИИПИ Заказ 4672/28 Тираж 523 Подписное

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 34 при различных исходных концентрациях фенола.

B табл. 3 дана активность фенолоксидаз при различных рН (Ь ма за 2-3 с 1 мг фермента), концентрация фенола 1 ° 10 4M, Таким образом, предлагаемый способ позволяет расширить класс определяемых фенолоксидаз, повысить експрессность определения (так как, время определения уменьшается с 5-10 мин до 2-3 с).