Способ получения сорбента для очистки белков
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ,включающий присоединение специфического пиганда к модифицированному силохромному носителю, отличающийся тем, ЧТО; с целью повышения сорбционной емкости сорбента , и в качестве лиганда используют ароматические азосоединения с реакционноспособньми винилсульфоновыми группами. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве ароматических азосоединений с реакционноспособньами винилсульфоновыми группами используют активные красители - производные нафтилазоили пиразолилазобензола или их медные комплексы. 3.Способ по пп. 1и2, отл иО 9 чающийся тем,что присоединение ведут при массовом соотношении (Л 1Носителя и лиганда 1:0,025-0,08,
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
3(59 В 01 J 20 22
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВ (21 ) 3443191/23-26 (22) 26.05.82 (46) 15.12.83. Бюл. М 46 (72) О.Ф. Суджювене, С.С. Флаксайте, A.Ì. Гумаускайте, Б.Б. Башкевичюте, В.A. Кадушявичюс, И.-Г.И. Песлякас и A-С.A. Глемжа (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 661 ° 183.1 (088.8) (56) 1. Патент Великобритании
М 2015552, кл. С 3 Н 1979.
2. Авторское свидетельство СССР
9 935121, кл. В 01 D 15/08, 1979 (прототип). (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. COPSEHTA ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, включающий присоединение специфического
„„SU„„0217 A лиганда к модифицированному сило хромному носителю, о т л и ч а юшийся тем, что с целью повышения сорбционной емкости сорбента, и в качестве лиганда используют ароматические азосоединения с реакционноспособными винилсульфоновыми группами.
2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве ароматических аэосоединений с реакционноспособными винилсульфоновыми группами используют активные красители — производные нафтилазо- или пиразолилазобензола или их медные комплексы.
-3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и- а ч а ю шийся тем,что присоедине- Е ние ведут при массовом соотношении:
I ,носителя и лиганда 1:0,025-0.,08.
1060217
1О
Изобретение относится к получению сорбентов групповой специфичности для очистки киназ,дегидрогеназ,ферментон обмена ну клен новыых кислот и фракционирования белков и может быть использовано в энэимологии. 5
Известен способ получения сорбентов групповой специфичности, включающий присоединение лигандаароматического азосоединения,содержащего реакционно-способные монохлор- или дихлортриазиноные грул— пиронки н водной среде в присутствии гидроокисей щелочных металлов при рН выше 8,0 к нецеллюлозному носителю, содержащему гидроксильные или аминогруппы с последующей промывкой полученного сорбента. В качестве лигандов используют активные красители монохлортриазинового ряда — процион красный НЗВ, процион красны НЕ3В, процион желтый H5G, процион красный H8BN, цибакрон голубой, 30А и дихлортриаэинового ряда — процион красный МХ2В, процион голубой МХ3 и процион желтый МХН, В качестве водонерастворимых носителей преимущественно используют агарозу, а реакцию присоединения к ней монохлортриазиноных красителей проводят при рН 9,5 в присутствии 0,05-0,2 11аОН при комнатной температуре 40-60 ч, а для дихлортриаэиноных красителей при рН 8-12,5 н присутствии 0,005-0,01
Na0H при комнатной температуре
1-4 ч. В обоих случаях н реакцион- 35 ную смесь вводят 0,25-0,5 N хлористого натрия. Концентрация вводимого в сорбент красителя составляет
7,5-15,0 мг/г сухого сорбента (1)
Однако согласно условиям реакции 40 присоединения используемых монохлор- и дихлортриазиноных красителей к носителю, известный способ обеспечивает введение в сорбент 7,0-15,0 мг красителя на 1 г сухого сорбента.
Принимая средний молекулярный нес используемых красителей 800, представленная концентрация составляет
8,75-18,7 мкЫ красителя/г сорбента.
Данная концентрация введенного в сорбент красителя является удовлетворительной лишь для сорбентов на основе целлюлозы. Однако ее использование в известном способе полностью исключается. Для основного носителя, используемого в известном способе, — сефарозы представленная концентрация красителя 7,0-15,0 мг/г сухого сорбента составляет всего лишь 0,35-0,75 мкМ красителя на 1 мл набухшего сорбента. Столь низкая кон-6О центрация вводимого в сорбент красителя отрицательно отражается на сорбционную емкость сорбентов и ограничивает возможности их использования для очистки ферментов, обладающих не- 65 высоким сродством к красителю и использованию сорбентов для извлечения ферментов из начальных экстрактов, в которых всегда присутствуют примесные белки, мешающие сорбции фермента.
Кроме того, испольэонание в качестве лиганда активных красителей монохлор- или дихлортриазинового ряда приводит к получению сорбентов, в которых связь носитель-краситель чувстнительна к действию кислых значений рН. В связи с этим возможность использования сорбентов для очистки ферментов или белков, обладающих кислыми значениями изоэлектрических точек, является ограниченной. Ограничены также возможности использования для регенерации сорбентон растворов с кислыми значениями рН.
Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому результату является способ получения сорбента групповой специфичности, включающий присоединение лиганда к силохромовому носителю, который предварительно модифицирован эпоксисмолой с последующим отверждением ее водным раствором полининилового спирта в присутствии полиэтиленамина, при весовом соотношении носитель:спирт 1:3-6 при 100105 $2) .
Изнестный способ характеризуется невысокой сорбционной емкостью полученного сорбента в отношении белков и нешироким диапазоном их использования.
Цель изобретения — повышение сорбционной емкости полученного сорбента.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, включающему присоединение лигандов ароматических азосоединений с реакционноспособными винилсульфоновыми группировками к модифицированному силохромному носителю при весовом соотношении носитель, лиганд
1:0,025-0,08, в качестве лиганда используют ароматические азосоединения с реакционноспособными винилсульфоновыми группировками.
Кроме того, в качестве ароматических а.зосоединений с реакционноспособными винилсульфоноными группами используют активные красители производные нафтилазо- или пиразолилазобенэола или их медные комплексы.
Присоединение ведут при массовом соотношении носителя и лиганда
1:0,025-0,08.
По предложенному способу в качестве ароматических азосоединений, содержащих винилсульфоновые группировки и ион меди, используют активный красно-коричневый 2КТ вЂ” медный комплекс 1-(P-cyzsgaroarzzcyrrr -сульфатоэтилсульфонил)-3- Г2-окси- . / -3 -ацетамидо-5,8-дисульфонафтилазо)— -4-окси-бензола, активный желтый светопрочный 2КТ (ТУ 6-14-1057-74} медный комплекс 1-() -сульфатоэтил/ сульфонил)-3((-1-(4-сульфо)-3 -метил-5-.окси-пиразолил) -азо)-4-оксиI -бензола и активный желтый 2КТ (ТУ 6-14-1057-74) и -1-{p-сульфатоэталсульфонил)-3-1 (1- 4 -сульфо)-3 -метил-5(-окси-пиразолил) -a3o)— -4-метокси-бензол. В качестве модифицированных силохромных носителей используют аминопропилсилохроммы С-80 или CX-2,5, модифицированные глутаровым альдегидом или водорастворимыми полисахаридами. Использование в качестве лигандов ароматических азосоединений,которые содержат в своей структуре реакционноспособные винилсульфоновые группировки, позволяет получать сорбенты с высокой устойчивостью к кислым значениям рН за счет образования связи между винилсульфоновой группировкой и носителем. Наличие иона меди с одной стороны повышает устойчивость связи лиганд-носитель, с другой стороны ион меди является дополнительным центром селективности по отношению белков или ферментов, что в свою очередь расширяет области использования сорбентов, включая ферменты класса оксндо-редуктаз, трансфераз, обмена нуклеиновых кислот и белки плазмы крови. Способ осуществляют следующим образом. Силохромный носитель модифицируют глутаровым альдегидом или декстраном, к модифицированному силохрому добавляют раствор азокрасителя при весовом соотношении 1:0,025-0,08, смесь перемешивают при нагревании. Полученный после фильтрации сорбент промывают водой. Пример 1. Получение сорбентов групповой специфичности на основе неорганических носителей, модифицированных глутаровым альдегидом. К 4,26 г силанизированного силохрома С-80 (концентрация -NH2— -групп-120 мкМ/г) прибавляют 5,1 мл 25%-ного глутарового альдегида (ренал; BHP) и 7,0 мл воды н реакцион-. ную смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре, после чего носитель отфильтровывают, промывают водой, 0,1 М На НСО содержащим 0,2-0,3% боргндрида натрия в течение 2 ч и водой. К мОдифицирован-. ному таким образом силохрому С-80 прибавлю т 5 мл воды, смесь нагревают до Э С и при перемешивании о прибавляют небольшими порциями раствор 105, 66 мг (131, 2 мкМ, 5 30,79 мкМ/1 г носителя).активного красителя, красно коричневого 2КТ в 5 мл воды. Реакционную смесь перемешивают при 60 С 0,5 ч, прибавляют 1,8 г Na С» перемешивают 1 ч, )p температуру смеси повышают до 80 С, 9 прибавляют 156,0 мг М g CO) и перемешивают при 80 С 3 ч. Смесь фильтруют и полученный сорбент промывают водой до прекращения вымывания кра 5 сителя. Концентрацию красителя в сорбенте определяют из разницы между взятым его количеством по навеске и . найденным в промывных водах измерением оптической плотности растворов при максимуме поглощения, красителя 530 нм, используя молярный коэффициент экстинкции 13500М см Концентрация кра еителя в сорбенте составляет 26,2 мкМ/г,или 10,1 мкМ/1 мл или 21,2 мг красителя/1 r сорбента. Пример 2. К 3,9 г силаниэированного силохрома С-80, модифицированного глутаровым альдегидом,как описано в п" эре 1, прибавляют Зр 99,66..мг (3,16 мкМ, 31,6 мкМ/г носителя) активного красителя краснофиолетового 2КТ в 4,0 мл воды. Реакцию присоединения красителя к носителю проводят аналогично примеру 1, 35 с тем различием, что количества 5аС6 и Na»cOy составляют соответст венно 1,7 г и 150 мг. Концентрация красителя в сорбенте, определенная по примеру 1, используя 4р коэффициент экстинкции для краснофиолетового 2КТ-34000М 1 см при 3m » - =545 нм является равной 22,5 мкМ/г или 8,8 мкМ/мл или 18,2 мг красителя/1 г сорбента ° 45 Пример 3. K 15,0 r силанизированного силохрома С-80, модифицированного глутаровым альдегидом,как описано в примере 1, прибавляют 310,8 мг (453,1 мкМ,30,2 мкМ/г носителя) активного красителя желтого светопрочного 2КТ в 15 мл воды. Реакцию присоединения красителя к носи» телю проводят аналогично примеру 1, с тем различием, что количества ЯаС0 и йа q CO составляют соответ55 ственно 6,0 r и 537 мг. Концентрация красителя в сорбен те, определенная по примеру 1, используя коэффициент экстинкции для желтого светопрочного 2КТ-24100М см 60 приЭ,»»= 450 нм является равной 24,8 мкМ/г или 9,2 мкМ/мл или 17,0 мг красителя/1 r сорбента. Пример 4,. Получение сорбентов групповой специфичности на основе неорганических носителей, моди651 1060217 Сорбционная емкость на. 0,8 г сорбента по гексокиназе, ед альбумину, мг гемоглобулину,мг Сорбент Аминопропилсилохром: С-80 модифицированный глутаровым альдегидом — красно-коричневый 2КТ 482,4. 45,4 23,3 Аминопропилснлохром СХ-2,5 ,модифицированный декстраном 40000-красно-коричневый 2КТ 392,7 52,5 27,? 377,0 Прототип Техйико-экономический эффект, более высокой сорбционной емкостью предложенного способа обусловлен 55 по отношению к ферментам и белкам. Составитель В. Виноградова! Редактор Н. Горват Техред И,Метелева, КорректорО. Тигор е Заказ 9905/5 . Тираж 537 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4 фицированных растворимыми полисахаридами. К 5,0 мл 10%-ного раствора водорастворимого декстрана, например с молекулярной массой 40000 в 0,5. ,ЙаОН вводят 0,24 мг эпихлоргидрида и раствор перемешивают 2 ч при 30 С. о Затем вводят 1,0 г аминопропилсилохрома СХ-2,5. (содержание аминогрупп 345 мкМ/г), температуру реакционной смеси поднимают до 78 С и перемешивают 3 ч, По завершении реакции носитель отфильтровывают, промывают 10 мл вуды и выдерживают 15-20 ч при 90-95 С, после чего его промывают водой, 0,1 М НС1, 0,1 МИаОЙ водой. Еерут 20,0 г модиФицированного таким образом носителя,прибавляют 50 мл воды температуру смеси поднимают до 60 С и при перемешивании прибавляют раствор 1,65 г красителя красно-коричневого 2КТ (82,5 мкМ/г носителя} в 140 мл воды. Перемешивание продолжают 0,5 ч, .после чего прибавляют 20,8 r хлористого натрия, реакционную смесь перемешивают 1 ч при 60 С. Температуру смеси поднимают до 80 С,при о бавляют 1,8 г натрия углекислого (йа CO ) и перемешивают при 80 С в течение 2,5-3 ч. Продукт реакции отфильтровывают и промывают водой до прекращения вымывания красителя.. Концентрацию красителя в сорбенте определяют как в примере 1.. Концентрация красителя в сорбенте составляет 22 мкМ/г или 7,6 мкМ/мл или 17,6 мг/1 г сорбента. Аналогично примеру 2 получают сорбент .на основе силохрома. С-80. Концентрация красителя красно-коричневого 2КТ составляет 23,0 мкМ/г или 7,9 мкМ/мл или 18,4 мг/г сорбента. 5 Для определения пригодности сорбентов для очистки кофакторзависимых ферментов и белков используют базовый препарат дрожжевой гексокиназы, полученный после автолива пекарских 10 дрожжей, фракционирования сульфатом аммония, диализа и лиофильной суш- ки, (удельная активность гексокиназы 10-25 кд/мг белка), альбумин человеческой сыворотки (Реанал, ВНР), 5, гемоглобин, (Мерк, ФРГ), цитохром, с (Серва,ФРГ). Пример 5. Хроматография дрожжевой гексокиназы. В хроматогра20 фическую колонку (1,0-5,0 см) загружают 1,0 мл сорбента, полученного как в примерах 1-4. Сорбент уравно-. вешивают 10 мМ трис-HCE буфером рН 6,5, содфржащим 5 мМ М8С?2 6Н20 25 н .0,5 мМ ЭДТА. На колонку наносят 0,5-2,0 мл раствора базового препарата фермента в исходном буфере. Концентрация: белка 6,0-10,0 мг/мл, удельная активность 16-33 ед/мг 30 белка. При элюции 50-80 мл исходного буфера отмываются балластные белки. Активный фермент десорбируют линейным градиентом К а С от 0-1, 0 в исходном буфере. Сорбционная емкость 35 сорбентов по отношению гексокиназы представлена в таблице.
