Способ определения адгезивных свойств бактерий

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕ ЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ путем смешивания эритроцитов человека и микроорганизмов с последующими инкубацией , отьшванием неприкрепившихся клеток и определением адгезивуых свойств, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, используют эритроциты хозяина, при этом их . смешивают с микроорганизмами в соотношении 1:10 и инкубирование веjj T при встряхивании.

3(я) С 12 К 1 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, н аитаесномм свидатвъств

ГОС ДАРСТЮЕННЫЙ КОМИТЕТ 0ССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3421146/28-13 (22) 22;02.82 (46) 28,02.84.баюл. 9 8 (72) В.И.Брилис, T..A.Брилене, Х.П.Ленцнер и A.A.Ëåíöíåð (71) Тартуский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет (53) 615 ° 375 (088.8)

1(56)Я3апаз. М., Kahane У., Rasin S.

Bredt W. A6herence of Иусор1азша .gallisepticum to human erytrocytes

Infect. Immun.1978, 21, 2, 365 372.,SU„„i1 076441, А (54 ) (57 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ путем смешивания эритроцитоь человека и микроорганизмов с последующими инкуба- . цией, отмыванием неприкрепившихся клеток и определением адгезивуых свойств, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения и повы- шения точности способа, используют эритроциты хозяина, при этом их . смешивают с микроорганизмами в соотношении 1г10 и инкубирование ве, .дут при встряхивании.

1076441

Изобретение относится к медицине, преимущественно к Микробиологии, и может быть использовано при определении болеэнетворности микроорганизмов и механизмов инфекции.

Известен способ определения адгезивных свойств бактерий путем изучения адгезии микоплазм на нативных эритроцитах Г13.

Однако этот способ обладает недостаточной точностью и является трудоемким при выполнении °

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения адгезивных свойств бактерий путем смешивания эритроцитов человека и микроорганизмов с последующими инкубацией, отмыванием неприкрепившихся клеток и определением адгезивных свойств используют эритроциты хозяина, при этом их смешивают с микроорганизмами в соотношении

1:10 и инкубирование ведут при встряхивании.

Способ выполняется следующим об разом.

Микроорганизмы предварительно смешивают с эритроцитами хозяина в.

0,5 M растворе трисбуфера, инкубируют при 35-37 С во влажной камере в течение 25-30 мин, высушивают, . фиксируют, окрашивают и после оценкипод световым микроскопом отбирают необходимые штаммы бактерий, которые после отмывания смешивают с эритро-. цитами в концентрациях соответствен- но 1 млрд/мл и 100 мпн/мл, затем

Смесьь инкубируют при 35-37 С на встряхивателе в течение 25-30 мин и после высушивания, Фиксирования и окрашивания производят под .световым микроскопом окончательную оцен ку адгезии.

Пример. Х этап - предвариб тельный опыт. Предназначен для быстрого определения адгезивных свойств большого числа штаммов бактерий.

Буферный раствор. Во всех опытах используют 0,05 M раствор трисбуфера, приготовленный на 0,87 М растворе хлористого натрия.

Взвесь бактерий ° Односуточные культуры микробов, хорошо растущих на скошенном агаре или какой-либо другой питательной среде,,смывают

2,0 мп буферного раствора рН 7,27,3 при 37 С.

Взвесь эритроцитов. Кровь из локтевой вены берут в пробирку с гепарином: одна капля гепарина на

5 мл крови. Эритроциты дважды отмывают буферным раствором рН 7,2-7,3 при 37 С на центрифуге (300 об/мин)

Готовят взвесь эритроцитов на укаI занном буфере концентрацией

1 млрд/мл.

Постановка опыта. На необезжиренное предметное стекло наносят од-! ну каплю буферного раствора рН 7,2° 5 7,3 при 37 С в которую суспеидиру.ют по одной петле взвесей бактерий и эритроцитов. На одном предметном .стекле можно одновременно ставить до пяти опытов. Предметное стекло

Я помещают во влажную камеру на 30 мин при 37б С, затем высушивают на воздухе, Фиксируют метанолом 10 мин, окрашивают по Граму. Для получения более контрастных препаратов при ра 5 боте с грамположительными микробами окрашивание кристалвиолетом продолжают 45 с, раствор Люголя выдерживают 30 с, обесцвечивают спиртом

1 мин и докрашивают фуксином Пфейфера 2 мин с грамотрицательными микробами соответствующее время - 2 и

1 мин, 15 и 30 с. Изучение адгезии ведется под световым микроскопом, а оценка-адгезивных свойств прово5 дится с помощью тРех показателейС, T .и О, высчитываемых на 25 эри-. троцитах.

С вЂ” среднее количество микробов, прйкрепившихся к одному эритроциту.

Т вЂ” наличие направленности (таксиЗО са )микробов к эритроцитам 0 - нет

{неприкрепившиеся бактерии более или менее равномерно разбросаны между эритроцитами), 1 - слабый таксис (менее половины неприкрепившихся

35 бактерий располагаются вокруг эритроцитов), 2 - сальный таксис (подав.ляющее большинство неприкрепившихся бактерий располагаютсж вокруг вритроцитов). О - занятость окружности

4О эритроцита прикрепившимися микробами: 0 — прикрепления нет или на единичных эритроцитах единичные микробы,. 1 - занято до 1/4, 2 - до 1/2, 3 - до 3/4, 4 — более 3/4 окружности

45 большинства эритроцитов.

Дпя микробов, плохо растущих на твердой питательной среде {например лактобациллы) используют жидкую питательную среду. На предметное стек ло наносят каплю, буферного раствора который после смешивания с одной петлей микробов в питательной среде и одной петлей взвеси эритроцитов обеспечивает РН 7,1-7,3 ,(пределы, в которых эритроциты сохраняют йормальную форму).

1 этап дает предварительное представление об адгезивных свойствах бактерий.

?У этап — основной с Ъыт. Предна60 эначен для более точного определения адгезивных свойств бактерий, выясне-. ния,влияния свойств клеток микрои макроорганиэма на процесс адвезии.

Взвесь бактерий. Односуточную культуру на плотной или в жидкой пи1076441

3 41 9,3

2,84 12,3

Li lactis:

3,16 13,0 3,68

8,1 .

1,49 11,7

19,3

1,64

L. helveticus

16,9 2,58 12,4

acilophilus

1,86

208 162 ". 2 37 11 8

9,4

7,97

L ° 8 ь1 1уйй 1 us

6,54

4,6

11,2 2,44 9,8

2,10

7,26

L. casei

4,0

Аз, 7,97

8,6

7,01 4,1

Ag 7,55 р (0,01

7, 7

Ь. pl antarum

8,1

3,21

12,0

Ь.: f. erm e n t um

3,42

8,8 3,50 5,2

16-, 2

4,58 7,5 °

2,67 9,0

6,55

3,22

1,97

14,g

Ь. breviв

buchneri

17,2 2,21 12,4

П.р и м е ч а н и е. ИАМ вЂ” индекс адгезивности микроорганизма, тательной среде дважды п-омывают раствором 0,05 M трисбуфера РН 7,27,3 при 37 С на центрифуге (1500 об/мин). Готовят взвесь микробов концентрацией 1 млрд/мл на указанном буферном растворе.

Взвесь эритроцитов. Готовят аналогично предварительному опыту, талько концентрация эритроцитов

100 млн/мл.

Постановка опыта. В пробирку вносят равные объемы (0,25-0,5 мл) взвесей микробов и эритроцитов, инкубируют при 37 С на встряхивателе

30 мин. Затем на тщательно обезжирей. ном предметном стекле готовят мазок, который обрабатывают аналогично таковому в предварительном опыте.

При оценке адгез.ивных свойств микробов используют показатели С„ Т и О, причем подсчет ведется на 100 эритроцитов, Кроме них определяют пока-. затель К - процентное содержание эритроцитов, имеющих на своей поверхности микробы, по отношению ко всем изученным эритроцитам.

Дпя изучения влияния микроорганизма на адгезию следует ставить параллельные опыты с эритроцитами различных людей и (или) животньпс.

II этап дает представление об адгезивных свойствах бактерий, о влиянии на процесс адгезии свойств клеток микро- и макроорганиэма.

Споооб отличается от аналогов и прототипа простотой и доступностью, возможностью изучения одновременно большого числа штаммов бактерий и клеток от различных людей и животных, получением количественной характеристики адгезни, позволяет одновременно изучить влия10 ние на адгезию свойств клеток микро- и макроорганизма.

Оригинальность способа состоит в выборе модели, где для изучения адгезивных свойств микроорганизма 5 используют эритроциты хозяина - носителя данного штамма. Концентрация микроорганизмов и эритроцитов 10:1

° в отличие от общепринятой 1000:1, кроме того, не проводят отмывания неприкрепившихся микробов. Отличается и оценка адгезии в способе.

Адгезивность и процент вариации результатов опытов при различных

t соотношениях эритроцитов и лактоба:цилл приведены в таблице.. Вариация результатов опытов у высокоадгеэивных штаммов при соотношении 1:100 в среднем 10,5%, а при 1г10 - 5,0%, у среднеадгезивных 12,1 и 8,0В, а у низко- и неадгезивных - 15,6 и

11,6% соответственно.

1076441

Составитель П.Бонарцев

Техред О.Веце;., Корректор С.Шекмар.

Редактор Е.Папп фВ аа

Заказ 650/22 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 г

Таким образом, использование пред.лагаемого способа приводит к досто- . вернощ увеличенив точности опытов (p а .0,01 ) в 2 раза.

Изменение соотношЕния микробов З и зритроцитов также значительно упрощает исследования. Отпадас т необходимость использования различных способов отмывания неприкрепившихся микробнык клеток, увеличивается воэможность изучения большого числа штаммов бактерий, сокращается время исследования.