Способ получения водорастворимых антигенов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ из ткани животных и человека путем ее гомогенизации , обработки хлористым калием с . последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта , гомогенат перед добавлением хлористого калия подкисляют до значения рН от 5.0 до k,0.

СООЭ СОВЕТСКИХ

ИЦ»

РЕСПУБЛИК (19) П1) Зсм А61К 3/00 - 3 дQ%%., ГОСУДАРСТВЕКНЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

I, °, с,:.г, g:., ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .."

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ .(21) 3381974/28-13 (22) 30. 10. 81 (46) 15.03.84. Бал. И 10 (72) 11. Б. Каргина, С.Н. Москвина и В.Я. Арион (71) 2"й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И. Пирогова (53) 615.366.37(088.8) (56) 1. Вязов О.Е. Лабораторная иммунология. Н., "Иедицина", 1967, с. 287. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИИМХ АНТИГЕНОВ из ткани животных и человека путем ее гомогениэации, обработки хлористым калием с . последуюцим центриФугированием и выделением целевого продукта, о тл и ч а ю шийся тем, что, -с целью повышения выхода целевого продукта, гомогенат перед добавлением хлористого калия подкисляют до значения рН от 5.0 до 4,0.

1 1079

Изобретение относится к медицине, а точнее к иммунохимии и касается выделения растворимых антигенов, и может найти применение в медицине, например s онкологии, для дифференциальной диагностики пролиферативных заболеваний и оценки состояния клеточного иммунитета, в трансплатологии для определения уровня специфических антител при криэах отторже- !О ния, а также в биохимии и биологии для изучения физико-химических свойств . и биологической активности антигенов клеточных мембран.

Известен способ получения водорастворимых антигенов иэ ткани животных и человека путем ее гомогенизации, обработки 3И раствором хлористого калия с последующим центрифугированием и выделением целевого про- о дукта Г13.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого про" дукта (10-133) поскольку после добавления к клеткам 3И КС! образуется 2s вязкий гомогенат, который подвергают диализу, что приводит к потере антигенного материала.

Цель изобретения - повышение количественного выхода целевого продукта. Зо

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения водор аст вори мых анти гено в из т кани животных и человека путем ее гомогенизации, обработки хлористым кали- ем с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, гомогенат перед добавлением хлористого калил подкисляют до значения рН от

5,0 до 4,0. . 40

П р и и е р 1. 3,56 r свежей ткайи„ полученной в результате биопсии или хирургической резекции, или взятой от трупа не позднее 2-4 ч после смерти„ гомогенизируют на ледяной ба-<5 не в стеклянном гомогенизаторе.Поттера в 0,83-ном растворе NaCl

0.04 И трис-НС1 буфере рН 7.3. температура которого 4-6ОС (вес: объем

1:9 ). В полученный гомогенат добав- 50

Ляют 0,1 И HC1 до достижения рН 4,5.

В подкисленный гомогенат при. постоянном перемешивании вносят по мере растворения сухой КС1 до конечной кон центрации ЗИ и оставляют при постоян- 55 о ном перемешивании на 16 ч при 4 С (в холодильнике) . Гомогенат центрифугируют при 48 000 об/мин (центрифуга

246

Beckrnan ро..ор 60 Ti) 90 мин, при О

4 С, супернатант обессоливают на колонке с сефадексом G-10 (2,5 10 см), концентрируют на мембранных фильтрах о

ИИ-2 (при, 4 С) и разбавляют на сеФадексе G-200 (2,5 ° 100 см) . Элюцию осуществляют 0,04 И трис-HCl буфером рН 7,4, содержащим 0,83 ИаС1, Материал, содержащий водорастворимые трансплантационные анти гены, выходит во внешнем объеме колонки (пробирки 13-16 на фиг. 1 сплошная линия)

Количество полученных частично очи- . щенных трансплантационных антигенов составляет 59,5i от исходной акти вности гомогената.

Il р и и е р 2. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что материал, взятый в качестве источника водорастворимых анти гено в хр а нит ся от нес кол ь ких дней до нескольких месяцев при20ОС.

Выход антигенного материала составляет 594.

Пример 3. Все процедуры выполняют как в примере за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 4,7. Выход антигенного материала составляет 59,21.

Пример 4, Все проадуры выполнялись как в примере 1 эа исключением того, что рН гомогената доводят до значения 4,9. Выход антигенного материала составляет 58,9>.

Пример 5.. Все процедуры выполняют как в примере за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 5,0. В этом случае де" зокси- и рибонуклеопротеиды выходят в раствор, гомогенат становится вязким и выделение ведется по прототипу. Выход антигенного материала. составляет 13,33.

П.р и м е р 6. Все процедуры как в примере 1 эа исключением того, что рН гомогената доводят до значения

4,0. Выход антигенного материала составляет 453.

Пример 7. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 3,5. Выход антигенного материала составляет 11/ °

Пример 8. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что рН .гомогената доводят до значения 2,0. Выход антигенм ного материала составляет 2 " з 10792

Пример 9. Все процедуры выпол няют как в примере 1 за исключением того, что сначала к исходному гомогенату добавляют сухой l(C1 до конеч" ной концентрации ЗМ, а затем в полученный вязкий гом генат добавляют

0,1 М НС1 до исчезновения вязкости.

Это достигается при значении рН 2,0.

Выход антигенного материала составляет 1,9l.

20

На чертеже представлены профили элюции препаратов растворимых трансплантационных антигенов на сефадексе

G-200.

Сплошная линия - профиль элюции антигенного материала, полученного по предлагаемому способу, пунктирная линия - разделение препарата, полученного по прототипу. На колонку 40

Предлагаемый способ получения водорастворимых анти генов поз воляе1 получать, в отличие от прототипа, довольно высокое количество раство- 15 римых антигенов (45-60@ вне зависимости от того, использовались ли в качестве исходного материала живые клетки или ткани животных и о человека, храни вшиеся при -20 С.

Последнее очень важно, так как позволяет накапливать материал и длительно сохранять его при отсутствии возможности провести выделение антигенов непосредственно 25 после забора материала. Проведена сравнительная оценка распределения на сефадексе G-200 антигенного материала, полученного по предлагаемому способу и по прототипу. 30

46 4 с сефадексом G-200 (2,5 100 см) уравновешенную 0,04 М трис-НС1 буФером, содержащим 0,84 NaC1, нанесены равные объемы проб препаратов (11 мл 1, полученных двумя разными методами, содержащие одинаковую концентрацию белка (10 мг/мл). Элюцил проводится тем же буферным раст" вором при скорости 20 мл/ч. Антигенный материал, определяемый по методу ингибирования цитотоксического действия специфической антисыворотки содержится в 13- 16 фракциях, т.е. в свободном объеме колонки. Из представленных на чертеже профилей элюции видно, что препарат, полученный по предлагаемому методу, присутствует в максимально недеградированной

Форме, по сравнению с антигенным препаратом, полученным по прототипу.

Удельная активность препарата, полученного по предлагаемому способу в объединенных Фракциях 13-16 составляет 214 АЕ/мг по сравнению с удельной активностью препарата, полученного по прототипу и равной 110 АЕ/мг (АЕ - антигейная единица).

Таким образом, способ получения .водорастворимых антигенов позволяет расширить сырьевую базу (возможность использования наряду с живыми клетками материал, хранившийся при -20 С), увеличить количественный выход растворимого антигенного материала с

10- 134 до 55-594, получить антигенный материал в недеградированной форме с большой удельной активностью, уменьшить затрачиваемое по получению антигенов рабочее время на 1520> за счет ликвидации этапа диализа.

Заказ 1196/3 Тираж. 688

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель Г. Крюкова

Ф

Редактор Т. Парфенова Техред Л. Коцюбняк Корректор А. Повх