Способ получения фосфолипидов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПВДОВ путем ферментативной переэтерификации лецитина фосфолипазой D в присутствии спиртовых акцептордв и активатора в буферном растворе, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, сокращения продолжительности процесса, в качестве активатора используют гексан при соотношении реакционной смеси, спиртового акцептора и гексана 15:

СОЮЗ СОВЕТСНИХ .

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И), Зсю A 23 Z 7 00

Ф4 Г о (1,„, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3461355/28-13 (22) 11.05.82 (46) 30.03.84. Бюл. и 12 (72) M M. Рахимов и М.У. Бабаев (71) Среднеазиатский научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт пищевой промышленности (53) 665.372(088.8) (56) 1. Sukhendy В., Maudal BarimaI С., Sen. and Pary chakrabarti.

Phybochemistry, 1980, Ф 8, р. 1661—

1663.

2. Pawson R.М.С. Biochem, Z, 1967, 102, р. 205-210 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ путем ферментативной переэтерификации лецитина фосфолипазой D в присутствии спиртовых акцепторов и активатора в буферном растворе, отличающийся тем, что, О с целью повышения выхода целевого продукта, сокращения продолжительности процесса, в качестве активатора используют гексан при соотношении реакционной смеси, спиртового акцептора и гексана 15:(2-10):(1-3); при этом используют фосфолипазу D, полученную из корнеплода среднеазиатской редьки Rap«anus sativus в количестве 0,02-0,04.

1082374

Изобретение относится к технической биохимии, а именно к способам получения фосфатидов, и может быть использовано в масложировой, кондитерской, хлебопекарной отраслях пищевой промьппленности, а также в медицинской и фармацевтической промьппленности.

Осуществление этого способа в отсутствие активаторов неэффективно, fp выход фосфолипидов очень низок и составляет 1,2-12,2Х для различных спиртовых акцепторов.

В связи с этим для повышения выхода фосфолипидов в известных способах применяют различные активаторы.

Известен способ получения фосфо— липидов путем ферментативной переэтерификации лецитина фосфолипазой D из листьев капусты путем использо- gp вания в качестве активатора больших количеств диэтилового эфира (507 от объема реакционной смеси).

Реакцию проводят при 25 в течео ние одного часа, рН среды составляет

5,8 а О,! И ацетатном буфере. Расход ферментного препарата 250 г на

1 моль лецитина.

Выход реакции в этом случае достигает 287. (1) .

Недостатком данного способа является длительность процесса и большой расход катализатора.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ полу-З5 чения фосфолипидов путем ферментативной транспереэтернфикацией лецитина с использованием в качестве ферментного препарата фосфопипазы 0 из

40 листьев капусты и использованием в качестве активирующего воздействия обработку ультразвуком. Выход фосфолипидов (соответствующий проценту лицитина, превращенного в другие фосфолипиды) достигает 207.

В качестве активатора реакции используют также анионный детергент додецилсульфат натрия, при этом выход получаемых фосфолипидов составляет 18-327., а в оптимальных условиях проведения процесса она может достигнуть 467.. Реакцию проводят при

27 при рН 5,4 в 0,1 И ацетатном буфере в течение 50 мин. Расход ферментного препарата 120 г на 1 моль лецитина, (2j .

Однако известный способ не обеспечиeàå Y высокого выхода целевого продукта.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта, сокращение про1 должительности процесса.

Укаэанная цель достигается тем, что в способе получения фосфолипидов путем ферментативной переэтерификации лецитина фосфолипаэой D в присутствии спиртовых акцепторов и активатора в буферном растворе в качестве активатора используют гексан при соотношении реакционной смеси, спиртового акцептора и гексана 15:(2-10):

:(1-3), при этом используют фосфолипаэу D, полученную из корнеплода среднеазиатской редьки Raphanus sativus в количестве 0,02-0,04.

Способ осуществляют следующим образом.

На первой стадии готовя- суспензию лецитина в воде, используя гомогенизатор PT-1 с числом оборотов

8000 об/мин (в течение 10 мин).

К i, 25 л приготовленной таким образом суспензии при перемешивании добавляют последовательно 2-10 л спиртового акцептора, О, 1-2,0 л раствора хлористого кальция с концентрацией 50 г/л, 0,1 л ферментного раствора с концентрацией О,"-10 г/л, 15 л одного из двух буферных растворов (ацетатного или трнс -НС Р) и воду до конечного объема 25 л.

К приготовленной смеси добавляют активатор гексан в количестве 1-3 л о и проводят реакцию при 5-45 С в течение 10-180 мин. После окончания реакции к ней добавляют равный объем хлороформа для остановки реакции и экстракции фосфолипидов и хлороформенный слой отделяют декантацией.

Обработку хлороформом повторяют дважды. Объединенные хлороформенные вытяжки фосфолипидов отгоняют под вакуумом (40 мм рт.ст.), используя роторный испаритель с числом оборотов

40-60 об/мин. После отгонки растворителя целевой продукт растворяют в хлороформе до концентрации 107. и добиваются окончательной очистки его пропусканием через колонку с силикагелем марки КСК й- 2. Соотношение силикагеля и фосфолипида составляет

15: 1.

Колонка промывается смесью хлороформ-метанол сначала с соотношением

9: 1 и при этом вымывается целевой продукт, затем с соотношением 2:1 для вьпчывания непрореагировавшего фосфолипида.

1082374

Выход фосфолипидов, %. по способу

Фосфолипид предлагаемому известному

Фосфатидиловая кислота

Фосфати- Исходдиловая ный кислота продукт

Исход- Целевой ный продукт продукт

Целевой продукт

Фосфатидилметанол

6,7 86,3 43,5-54;3 3,2-6,4 53,3-39,3

7,0

Фосфатидилэтанол

3,2 84,6 27,0-47,3 4,3-7,8 68,7-44,9

12,2

Фосфатидилпропанол

2,5 92,8 28,5-45,0 5,7-8,5 65,8-46,2

4,7

Таблица 2

Выход фосфолипидов, % от исходного лецитина при количестве активатора, мл/л рН

Спиртовый акцепто среды

40 80 120

5ОС 30оС 45ОС 5 С 30 С 45оГ 5ос 30 С 45 С

5,6 12,4 50,3 54,4 12,1 50,0 47,8 11,5 47,7 43,5

7,2 10,2 36,1 40,6 10,8 38,4 37,5 9,6 35,5 26,4

5,6 8,0 30,0 47,3 9,00 34,7 47,1 7,8 27,0 30,3

7 2 7,3 25,0 28,3 8,5 23,4 27,0 6 5 21,6 23, 1

Метанол

Этанол

Результаты выхода фосфолипидов представлены в табл. 1.

Пример 1, Синтез фссфатидилметанола фосфолипазой D в реакцион" ной среде с рн 5,6. Концентрация компонентов в реакционной среде: лецитин 5 мм, CaCl, 40 мм кальция,ферментный препарат 0,04 г/л, метанол

120 мл/л, гексан 40 мл/л. Реакцию проводят при 5 С в течение 20 мин !О (табл. 2). Выход целевого продукта составляет 12,4%.

Пример 2. Все эксперименты проводят как в примере 1, но при рн !5 среды 7 2. Выход целевого продукта составляет 10,2% (табл. 2).

Пример 3. Все операции проводят как в примере 1 и 2, но при

30 С. 20

Данные представлены в табл. 2.

П р и и е р 4. Все операции про водят как в примере и 2, но при

45 С.

Данные с другими спиртовыми акцеп торами приведены в табл. 2.

Пример 5. Реакцию синтеза фосфатидилметанола проводят как в примере 3, но продолжительность реакции 10-180 мин. Концентрация компонентов в реакционной среде: лецитин

2,5 мм, СаС1 40 мм кальция, ферментный препарат 0,04 г/л, метанол

120 мл/л, гексан 20 мл/л.

П.р и м е р 6. Реакцию синтеза фосфатидилметанола проводят как в примере 3, используя ферментные препараты иэ различных источников.

Данные приведены в табл. 3.

Предлагаемый способ позволит получить новые виды фосфолипидов и увеличить выход на 10-30%.

Т а б л и и а

1082374

Продолжение табл, 2

Выход фосфолипидов, X от исходного лецитина при количестве активатора, мл/л рН среды

Спиртовый акцептор

120

5 С 30 С 45ОС

5 С 30 С 45 С

8,3 32,5 Зб,б 7,8 28,5 33,3

7,5 31,4 25,0 7,1 29,2 26,3

5,6 7,4 30,6 45,0

7,2 6,6 32,5 38,5

Пропанол

Таблица 3

Выход фосфатидипметанола в зависимости от вида ферментного препарата при рН 5,6

Параметры

Семяна хлопчатника

Листья капусты

Корнеплоды редьки

Продолжительность реакции, мин

20

50,3

30,3

34,2

54,3

Составитель Е. Буданцева

Редактор П.Макаревич Техред С.Легеэа Корректор Л. Повх

Заказ !598/2 Тираж 589 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, E-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выход продукта при

30 С

4О

5 С 30 С 45 С

19,5

24,2