Способ получения кислой дезоксирибонуклеазы

 

(19) (И) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

%51) С 12 N 9/16

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOIVlY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3574600/28-13 (22) 14.12.82 (46) 30.06.84. Бюл. Р 24 (72) 10.В.Федосов, В.Б.Кожемяко и В.A.Рассказов (71) Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного научного центра AH СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Biochim Biophys Acta, 1966

129, 1-11.

2. Biochim Biophys Acta 1971, 228, 95-104. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОЙ

ДЕЭОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ, включающий экстрагирование животной ткани кислым водным раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, обессоливание и выделение целевого продукта с помощью хроматографии, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, упрощения процесса, экстрагированию подвергают печень минтая, а хроматографию обессоленного ферментного раствора осуществляют на фосфоцеллюлозе с элюцией буфером рН -7,1-7,2, а затем на анионообменнике с элюцией тем же буфером, содержащим 0,3-0,35 И NaC1.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве анионообменника используют ДЭАЭ-целлюлозу. а или ДЭАЭ-сефадекс, или ТЭАЭ вЂ” целлю- Е лозу, илн АЭ-целлюлозу.

11ООЗО8

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается производства ферментных препаратов, а именно к способу получения кислой дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы ) из животного сырья. 5

Известен способ выделения и очистки кислой ДНК-азы из селезенки свиньи, который заключается в приготовлении кислого водного экстракта из свежей селезенки, подкислении экстракта до рН 2,5, двухступенчато го высаливания белна, содержащего кислую ДНК-азу, сульфатОм аммония с последующей хроматографической очисткой обессоленного сырья ферментного препарата, которая включает,три последовательные стадии: хроматографию на диэтиламиноэтил-сефадекс, хроматографию на гидроксилапатите, хроматографию на карбоксиметил-сефадексе. Этим способом достигается очистка двух ферментных препаратов

Днк-аз t 13. Выход по активности 4,9 и 19,3о; выход по белку 0,018 и

0,07 соответственно.

Недостатками этого способа выделения являются низкий выход целевого продукта, длительность и многостадийность очистки, а также использование на второй стадии очистки фермента хроматографии на гидроксилапатите. Метод хроматографирования ферментов на гидроксилапатите является сложным, трудоемким, плохо воспроиз" водимым и поэтому не применяется в широкомасштабном биохимическом 35 произ водстве.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения кислой ДНК-азы из семенников лосося, который заключа- 4Р ется в экстрагировании животной ткани кислым водным раствором, фракционировании экстракта сульфатом аммония, обессоливании, после чего фракции, обладающие ферментативной актив-4 ностью, собирают и после добавления к ним дитиотреитола (1 мМ) лиофилизируют. Лиофилизированный препарат фермента растворяют в разбавленном растворе 8aOkl таким образом, чтобы рН ферментного раствора равнялся

6, 7. Препарат фермента наносят на колонку с гидроксилапатитом (2,5х

11 см f, уравновешенным 0,04 М Na-фосфатным буфером, рН 6,7. После отмывки колонки этим же буфером осуществляют ступенчатую хроматографию, постепенно повышая концентрацию фосфата

М в элюирующем растворе. Кислая

ДНК-аза элюируется в 0,15 м На -фосФатном буферном растворе. На этом " 60 этапе конечный целевой продукт концентрируют, диализуют в течение ночи против водного раствора, содержащего

2,5 мМ 2-меркаптоэтанола, 5 мМ ЭДТА, рН 7, и оставляют храниться при -30 C 65

Известным способом получают 1,4 мг

ДНК-азы из 2 кг семенников лосося, что составляет 11% от активности сы рого ферментного препарата в экстракте. Достигнута очистка Фермента по активности в 5920 раз. Длительность способа 14-.16 дней L23.

Недостатками известного способа являются его длительность и сложность.

Кроме того„ на одном из этапов очист" ки ферментного препарата используют гидроксилапатит, что свидетельствует о сложности процесса, связанной со строгим соблюдением технических условий хроматографии. Способ не обеспечивает достаточного выхода целевого продукта (выход ДНК-азы по белку составляет 0,0019%1.

Цель изобретения - увеличение выходЬ целевого продукта и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения кислой ДНК-азы, включающему экстрагирование животной ткани кислым водным раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, обессоливание и выделение целевого продукта с помощью хроматографии, экстрагированию подвергаЮт печень минтая, а хроматографию обессоленного ферментнОго раствора осуществляют íà фосфоцеллюлозе с элюцией .буфером рН 7,1-7,2, а затем на анионообменнике с элюцией тем же буфером, содержащим 0,30,35 М NaCj..

В качестве анионообменника используют ДЭАЭ-целлюлозу или ДЭАЭ-сефадекс, или ТЭАЭ-целлюлозу, или АЭ-цел-. люлоз у.

Удельная активность кислой ДНК-азы, полученной данным способом составляет 50 ед. на 1 мг белка, степень очистки по активности 29,4 раза, выход Фермента по активности 31Ъ. Конечный целевой продукт не содержит интерферирующих примесных активностей-Фосфатаз и Фосфодиэстераз. Длительность процесса очистки 4-5 дней.

Пример г. 35 г свежемороженной печени минтая мелко измельчают и экстрагируют кислым водным раствором (дистиллированная вода, физиоло- . гический или буферный раствор, подкисленные серной кислотой до рН 2,5 ) в скоростном электрогомогенизаторе, центрифугируют при 8000х g в течение

30 мин при 4 С. Супернатант собирают и операцию повторяют еще раз для полного извлечения фермента из ткани. К объединенному супернатанту добавляют сульфат аммония ЗОВ насыщения при 20 С, перемешивают до полного растворения соли и оставляют на 5-6 ч при 4ОС для формирования осадка белка, который затем фильтруют через двойной бумажный фильтр 1100308

60 1,06 бб 1

66,8 1

72 1,15

31

30,4

32,7

29,4

30,9

30,2

28,2

ДЭАЭ-целлюлоза

ДЭАЭ-сефадекс

ТЭАЭ-целлюлоз а

АЭ-целлюлоз а

52,5

51,4

1,26

1,3

1,5 при 4 С. К фильтрату добавляют сухой сульфат аммония (85% насыщения ) при перемешивании и оставляют на 5-6 ч для полного осаждения белка. Осадок фильтруют через двойной бумажный фильтр или центрифугируют при 8000х 5 в течение 1 ч, растворяют в минимальном объеме 0,05 М аммоний-ацетатного буфера, 0,002 М ЭДТА, РН 5,35,4 и затем обессоливают на колонке с сефадексом Г-25, уравновешенной этим же буфером со скоростью 220240 мп/ч.

Обессоленный сырой ферментный препарат наносят на колонку (1,1х

6,3 см) с фосфоцеллюлозой, уравнове- 15 щенной 0,05 М аммоний-ацетатным буфером, 0,002 М ЭДТА, РН 5, 3-5, 4.

Колонку промывают этим же буфером до исчезновения УФ-поглощения в элюате при A-280 нм. Десорбцию фер- 20 ментного препарата, содержащего на-. ряду с кислой ДНК-азой кислую

РНК-азу, осуществляют 0,2 M Ha -фосфатным буфером с 0,001 М ЭДТА, РН 7,1-7, 2. Выход ферментного пре- 75 парата из колонки контролируют по

Увикорду (можно использовать Увикорд и самопйсец любого типа).

Полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе ферментный препа- З0 рат разбавляют дистиллированной водой в 10-12 раз и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1х10 см ), уравновешенной О, 02 М Na-фосфатным буфером, 0,001 М ЭДТА, РН 7,1. После предварительной отмывки колонки эти же буферным раствором, содержащим 0,1 M NaH, кислую ДНИ-аэу десорбируют 0,02 М N -фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и

0,3 М МАПСР, рН 7,1. 40

На этом этапе происходит отделение кислой ДНК-азы от кислой PHK-азы (кислая РНК-аза в условиях, приве,денных в примере 1, не сорбируется

)на анионообменнике), и полученный 45 препарат кислой ДНК-азы (конечный целевой продукт ),не содержит интерферирующих примесных активностей: фосфатаз и фосфодиэстераз. Из 35 г печени получают 1,38 мг кислой, 50

ДИК-азы (по белку), удельная активность фермента увеличивается в 29,4 раза по сравнению с исходной в сыром препарате.

Пример 2. Хроматография

ДНК-азы на колонке с ДЭАЭ-сефадексом.

Полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе ферментный препарат (как в примере 1) разбавляют дистиллированной водой в 10-12 раз и наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом (1х10 см ) уравновешенным 0,02 М

М-фосфатным буфером, 0,001 М ЭДТА, РН 6,9-7,2. После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М NaCf кислую

ДНК-азу десорбируют 0,02 М Кп -фосфатным буфером, содержащим- 0,001 М

ЭДТА и 0,35 М NaCe, РН 6,9-7,2.

Пример 3. Хроматография

ДНК-азы на колонке с ТЭАЭ-целлюлозой.

Препарат ДНК-азы, полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе (как в примере 1 ), наносят на колонку с ТЭАЭ-целлюлозой (1x10 см), уравновешенной 0,02 М Na -фосфатным буфером, 0,001 M ЭДТА, РН 6,9-7,2.

После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М йаИ, кислую ДНК-азу (конечный целевой продукт! десорбируют 0,02 М Na -фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и 0,3 М )чс N, РН б, 9-7, 2.

Пример 4. Хроматография

ДНК-азы на колонке с АЭ-целлюлозой.

Препарат, полученный после хроматографирования на фосфоцеллюлозе (как в примере 1), наносят на колонку с

АЭ-целлюлозой (1х10 см ), уравновешенной 0,02 М Na-фосфатным буфером, содержащим 0,001 M ЭДТА, рН 6,9-7,2.

После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим О, М NaCF, кислую ДНК-азу (конечный целевой продукт ) десорбируют 0,02 М Nct-фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и О, 3 М NaC<, РН 6,9-7,2.

Сводные . количественные данные очистки кислой ДНК-азы на последней стадии очистки с использованиемразличных анионообменников приведены в табл. 1.

Таблица1

1100308, Выход ДНК-азы по активности составляет 31,3%. Исследования свойств препарата кислой ДНК-аэы, получаемой по предлагаемому способу, показывают, что: оптимум рН фермента находится в области 5 0-5,5; фермент стабилен в широком диапазоне рН (4,0 8,0р для проявления активности препарат фермента не: требует ионов двухвалентных металлов; фермент расщепляет дНК по эндонуклеазному типу с образова- 10 нием 3 - концевых фосфатолигонуклеотидов; фермент проявляет высокую специфичность по отношению к ДНК,,среди продуктов гидролиэа преобладаТ а бл и ц а 2

Выход, Ъ, по

Общая ферментная активность, ед.

Удельная ферментная активность ед. на

1 мг белка

Общий белок, мг

Очистка по активно сти

Процедура очистки, белку активности

Обессоленный сырой ферментный препарат

Фосфоцеллюлоза

1,7 100

25 60

50 31,3

100

130 220

5, 27 132

14,7

4,05

ДЭАЭ-целлюлоза

1 38 . б9

1,06

29,4 ферментного препарата фосфоцеллюлозы и анионообменника приводит к уве4О личению выхода целевого продукта,сокращению длительности очистки ферментного препарата, упрощению процесса.

Составитель О. Скородумов

Редактор T.Âåñåëîâà Техред Ж. Кастелевич Корректор A.Èëüèí

Заказ 4543/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Проектная, 4

Таким образом, использование В данном способе в качестве источника, сырья для получения кислой ДНК-азы печени минтая, а в качестве сорбентов для хроматографической очистки

foT крупные олигонуклеотиды с молекулярной массой более 40 тыс.дальтон.

В табл. 2 представлены количественные данные процесса хроматографической очистки кислой ДНК-азы из печени минтая от стадии получе ния сырого ферментного препарата до выхода целевого продукта. За единицу активности фермента принимают такое коЛичество ДНК-азы, которое за 1 ч инкубации при 37 С приводит к образованию 1 ОЕ О z„кислоторастворимых продуктов гидролиза

ДНК.