Способ консервирования клеток @ @ @ -7

 

СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КЛЕТОК FUSARIUM MONILIFORME Pg-7 путем замораживания в среде криопротектора , отличающийся тем, что, с целью повьшения жизнеспособности клеток, замораживание производят со скоростью 1-2 С в мин от 1520°С до (-70) - (-90)С, а в качестве криопротектора используют 1-3%-ный раствор сахарозы, или 1-5%-ный раствор диметилсульфоксида, или 1-3%-ньй раствор глицерина.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

И

РЕСПУБЛИК.„Я0„„1110799 А

Всю С 12 М 1/00

- оr

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3330302/30-15 (22) 14.08.81 (46) 30.08.84. Бюл. У 32 (72) А.А.Цуцаева, Л.Н.Лаврова, И.П.Высеканцев, В.М.Маркова, Ю.А.Иткин, В.Л.Броншнейн, П.Г.Исерович и Г.А.Тренина (7Ц Институт проблем криобилогии и криомедицины АН УССР (53) 578.68(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Ф 457727, кл. С 12 N 3/00, 1977.

2. Цуцаева А.А. и др. — "Микробиология", т. 47, вып. 3, с. 446-450, 1978. (54) (57) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КЛЕТОК FUSARIUM NONILIFORME Pg-7 путем замораживания в среде криопротектора, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток, замораживание производят со скоростью 1-2 С в мин от 15б

20 С до (-70) — (-90) С, а в качестве криопротектора используют 1-ЗЖ-ный раствор сахарозы, или 1-5Х-ный раствор диметилсульфоксида, или 1-ЗЖ-ный раствор глицерина.

Исходная концентрация жизнеспособных клеток в пробе составила (1,7 +

+ 0,1425) ° 10" клеток/мл. После 15-минутной экспозиции в защитной среде образец охлаждения от 20 до -90 С со скоростью 1 С/мин. Затем образец погрузили в жидкий азот. После хранения в жидком азоте в течение 2 лет образцы отогрели на водяной бане при

28 С. Оценку качества клеток Fusari

um moniliforme Pg-7 проводили по количеству жизнеспособных клеток в образцах, морфологической сохранности клеток чашечным методом. Количество жизнеспособных клеток Fusarium moniliforme Pg-7 после хранения в течение 2 лет (1,7 0,2234)-10"клеток/мл, т.е. 100Х-ная жизнеспособность клеток.

IT р и м е р 2. Клетки Fusariun

moniliforme Pg-7 в объеме 1,5 мл, отмытые от ростовой среды, ресуспендировали в 3%-ном растворе сахарозы.

Исходная концентрация клеток в образце (1,7+0,1435) ° 10 клеток/мл.

После 10-минутной экспозиции образец охлаждали от 15 до -70 С со скоростью 1 С/мин. Затем образец погрузили в жидкий азот. После хранения в жидком азоте в течение 2 лет образцы отогрели: на водяной бане при 28 С.

Количество жизнеспособных клеток (1,7 0,3013) ° 10 клеток/мл.

Пример 3. Образцы клеток

Fesarium топiliforme Pg"7 в объеме

1,5 мл, отмытые от ростовой среды (среды Чапека), ресуспендировали в

57-ном водном растворе диметилсульфок,сида (ДИСО) . Исходная концентрация клеток в образце (1,7+0,2661) 10 клеток/мл. После 12-минутной экспозиции образец охладили от 18 до -85 С со скоростью 2 С/мин. Затем образец пою грузили в жидкий азот. После хранения образца в жидком азоте в течение

2 лет его отогревали на водяной бане нри 28 С. Количество жизнеспособных клеток в образце после хранения 1, 7 0 2804 IО клеток/мл или 100%.

В таблице показано влияние скорости охлаждения и концентрации криопротекторов на жизнеспособность клеток

Fusarium moniIiforme Pg-7 Исходная концентрация клеток 1,7 101.

Из таблицы видно, что высокая жизнеспособность достигается при охлаж1 1110799 2

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение при производстве гиббереллина, используемого в качестве кормовой добавки

\ в животноводстве. 5

Известен способ низкотемпературного консервирования микроорганизмов с помощью защитной среды, содержащей 10-50% глицерина, 5-20% сахарозы и 10% буфера (1 ). 10

Однако этот способ не обеспечива-, ет высокой жизнеспособности клеток

Fusarium moniliforme Pg-7, так как при наличии в защитной среде лимоннокислого натрия и при некотролируемой скорости охлаждения жизнеспособность клеток снижается.

Известен способ низкотемпературного консервирования бактерий, заключающийся в том, что микробные сус- 2б пензии замораживают до "196 С со . ь скоростью 400 С/мин под защитой криопротекторов глицерина или полиэтиленоксида мол.в. 400 в концентрациях 5 †1 (2 ). 25

Однако известный способ не обеспечивает высокой жизнеспособности клеток Fusarium moniliforme Pg-7.

При консервировании под защитой

ПЗО-400 жизнеспособность клеток 1,2%,3О под защитой глицерина 5GX.

Цель изобретения — повьппение жизнеспособности клеток Fusarium moniliКогте Pg-7.

Указанная цель достигается тем, что клетки Fusarium moniliforme Pg-7

35 замораживают со скоростью 1-2 С/мин от 15-20 С до (-70) — (-90) С в среде криопротекторов 1-3%-ной сахарозы, или 1-ÇX-ного глицерина, или

1-5%-ного диметилсульфоксида.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки Fusarium moniliforme Pg-7, отмытые от ростовой среды, ресуспендируют в 1-37-ном растворе глицерина, или в 1-5%-ном растворе ДМСО, или в 1-37.-ном растворе сахарозы. После

10-15-минутной экспозиции в защитной среде образец охлаждают от 15-20 С до (-70) — (-90) С со скоростью 12 С/мин. Затем образец погружают в жидкий азот, Отогревают образец на водяной бане при 28-30 С.

Пример 1. Образцы клеток

Fusarium moniliforme Pg-7 в объеме

1,5 мл, отмытые от ростовой среды (среды Чапека), ресуспендировали в

3%-ном водном растворе глицерина.

1110799

Количество жизнеспособных тканей при скорости охлаждения, С/мин о

Концент

P&H;HR

Криопротек торы

% 10 клеток/мл

10 клеток/мл

1,51

100

Глицерин

1,08

100

1,7

1,23

100

1,63

1,30

95,8

ДИСО

1,29

95,8

1,65

1,32

0,90

100

1,7

1,69

99,9

Сахароза

1,09

100

1,7

0,97

100

1ь7

Продолжение таблицы

Криопротек- торы

Количество жизнеспособных тканей при скорости охлаждения, С/мин

Ь 1 1

% 10 клеток/мл %

Глицерин

88,8

0,94

54,7

55,2

0,93

57,6

63,5

1,03

60,5

0,98

1,18

69,4

72,3

6,91

53,5

1 06

76,4

62,3

0,17

10,0

ДМСО

75,8

1,26

74,1

0,23

13,5, 77,0

77,6

1,31

0,19

Сахароза

0,76

52,9

44,7

64,1

1,26

74,1

31,7 0

57 0

0,54

ВНИИПИ Заказ 6263/21 Тираж 521 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.Узгород, ул.Проектная, 4

3 дении со скоростью 1-2 С в минут о при концентрации 1-3% глицерина, либо

1-3% схарозы, либо 1-5% диметилсульфоксида.

Таким образом, преимуществом пред" лагаемого способа является то, что он обеспечивает 100%-ную жизнеспособность клеток.