Способ определения пиридоксаля и пиридоксаль-5-фосфата при их совместном присутствии в растворе

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРДЦОКСАЛЯ И Ш1РИДОКСАЛЬ-5 -ФОСФАТА ПРИ toJO ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ В РАСТВОРЕ с использованием обработки анализируемой пробы химическим реагентом и измерением интенсивности флуоресценции образующегося соединения, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, анализируемую пробу обрабатывают раствором 0-метилгидроксиламина в Ma-ацетатном буфере с рН 4-5 до концентрации 0-метилгидроксиламина в пробе , раствор инкубируют, доводит рН до 6-7, измеряют интенсивность флуоресценции с последующим добавлением 0-метилгвдроксиламина до концентрации , доведением рН до 4-5, ин-, 9 кубированием раствора, доведением рН до 6-7, измерением интенсивности флуоресценции и расчетом по формуле. ал 00 со

СОЮЗ, СОВЕТСКИХ

NI ° IVICI

РЕСПУБЛИК ае 01>

01 А

3cSD С Ol N 21 64

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Л Й Ю

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

OS (21) 3446812/23-04 (22) 01.06.82 (46) 15.10.84. Бюл. К 38 (72) Н.П,Бажулнна, Л.А.Полякова, Е.В.Горяченкова, Ю.В.Морозов, P.М.Хомутов, Ю.М.Залесская и М.А.Крашенинникова (71) Институт молекулярной биологии

АН СССР и Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (53) 543.432(088.8) (56) I. Chauhan Y..S,,DakshinamurK. Fluorometric Assay of Pyridoxal and Pyridoxal-5 -Phosphate.

Anal, Biochem, 96, 426-432, 1979 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРИДОКСАЛЯ И ПИРИДОКСАЛЬ-5 -ФОСФАТА ПРИ .

ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ В РАСТВОРЕ с использованием обработки анализируемой пробы химическим реагентом и измерением интенсивности флуоресценции образующегося соединения, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, анализируемую пробу обрабатывают раствором

0-метилгидроксиламина в Ма-ацетатном буфере с рН 4-5 до концентрации

0-метилгндроксиламина в пробе 16Ъ, раствор инкубируют, доводят рН до

6-7, измеряют интенсивность флуоресценции с последующим добавлением

0-метилгндроксиламина до концентрации 10 М, доведением рН до 4-5, ин-, Е кубированием раствора, доведением рН до 6-7, измерением интенсивности флуоресценции и расчетом по формуле.

I IIIS

Изобретение относится к биохимии, преимущественно аналитической и клинической, и мож т быть использовано .в энэимологии и медицине.

Пиридоксаль-5 -фосфат. {ПЛФ ) является основной коферментной формой витамина В . В биологическом материале помимо ПЛФ всегда имеются и дру- гие соединения группы витамина В, в особенности пиридоксаль (ПЛ I 1п

Правильная картина состояния обмена витамина В может быть получена, если определяется не только количество самого ПЛФ, но и ПЛ, а также их суммарное содержание. Существующие микробиологические и энзиматические способы определения ПЛФ не позволяют проводить такой полный анализ.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигае-. мому результату является флуоресцентный метод определения ПЛФ и ПЛ, основанный на получении фотоустойчивых антранилатных производных. По этому методу анализируемую пробу обрабатывают метилантранилатом в абсолютном метаноле, нагревают, добавляют восстановитель, снова нагревают, подкисляют раствором HCC в метаноле, удаляют растворитель в вакууме, расI творяют в воде, подщелачинают, многократно извлекают водный раствор хлористым метиленом. Антранилатное производное ПЛ находится в органической фазе и его определяют после очистки на колонке с силикагелем и препаративной тонкослойной хроматографии. Для определения ПЛФ водную фазу-обрабатывают щелочной фосфатаэой, после чего необходимое произ.— водное выделяют хроматографией и иэ- 4О меряют интенсивность флуоресценции растворов антранилатных производ- . ных (1).

Недостатками данного метода являются многостадийность и необходимость выделения, очистки и разделения производных ПЛ и ПЛФ. Цель изобретения — упрощение способа определения ПЛ н ПЛФ при их совместном присутствии в растворе. 5р

Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу анализируемую пробу обрабатьаюают раствором 0-метилгидроксипамина в -Na-ацетатном буфере с рН 55

4-5 до концентрации 0-метилгидроксил,амина в пробе 10 М, раствор инкубируют, доводят рН до 6-7, измеряют

90I 1 интенсивность флуоресценции с последующим добавлением 0-метилгидроксиламина до концентрации 10 М, доведением рН до 4-5, инкубированием раствора, доведением рН до 6-7, измерением интенсивности флуоресценции и расчетом по формуле.

На чертеже показана кинетика убыли исходного продукта (1- о() в реакции 0-метилгидроксиламина с пиридоксалем и пиридоксаль-5 -фосфатом

I в О,1 M Ма-ацетатном буфере при рН 5,0 и температуре 25 С реакция при постоянной концентрации 0-метилгидроксиламина IО М и концентрации

ПЛ и ПЛФ, равных: 10- M; х x)p ь М; д LlIP

В основе предлагаемого способа лежит свойство ПЛФ образовывать 0метилоксим с большей скоростью, чем

ПЛ при прочих равных условиях. !

На первом этапе в оксим переводится весь присутствующий в растворе

ПЛФ и только часть ПЛ. Скорость преобразования ПЛФ (концентрации

4 I0 N) ooT eT B HH oKCHM . при избытке концентрации 0-метилгидроксиламина (ОМГА ) в растворе (на порядок или более по сравнению с концентрацией ПЛФ ) зависит только от концентрации реагента. Это проиллюстрировано на чертеже (кривая

ПЛФ ), где показана кинетика убыли исходного продукта при концентрации

ОМГА 10 М и концентрациях ГЛФ в пределах IO - 10 М. Концентрация реагента 10 М подобрана так, чтобы примерно через 40-50 мии, когда весь ПЛФ преобразуется в соответствующий оксим, аналогичная реакция преобразования ПЛ происходила заведомо менее чем íà IOX, На втором этапе в оксим переводится оставшаяся в растворе часть ПЛ.

Дпя этого концентрация реагента повышается до 10 М. При такой концентрации полное преобразование ПЛ в

его оксим завершается примерно через 30-40 мин. Повышение концентрации в этом случае ускоряет реакцию . ОМГА с ПЛ, причем дальнейшее увеличение концентрации на порядок (10 М ) дополнительно сокращает время реакции примерно в 5 раз.

Способ осуществляют следующим образом.

111890! 4

К исследуемому раствору сначала добавляют такое количество 0-метилгидроксиламина, чтобы концентрация его в исследуемом образце была порядка 10, и через определенное время производят измерение интенсивности суммарной флуоресценции 13 1 при рН 6-7, в которую вносит вклад свечение 0-метилоксима ПЛФ (Э„1, а также свечение 0-метилоксима ПЛ (23 10 образовавшегося в результате частичной трансформации ПЛ. Таким обра5 1 где о — доля трансформированного

ПЛ, определяемая из графика на черте" же.

Затем при рН 4-5 доводят концентрацию 0-метилгидроксиламина до величины порядка 10 М и спустя опре: деленное время при рН 6-7 снова производят измерение интенсивности суммарной флуоресценции (Э 1 которая г равна:

3 31 3 (2 25

Решая совместно уравнения (1) и (2 ) находят величины 3 и 3 и, сравни1вая их с. соответствующими калибровочными графиками для 0-метилоксимов

ПЛ и. ПЛФ, определяют концентрации ПЛ и ПЛФ. Этим методом определяются

ПЛ и ПЛФ в концентрациях до 10 М включительно при соотношении сигнал— шум 8:1.

Построение калибровочных графиков.

Готовят ряд растворов с заданными концентрациями ПЛ или ПЛФ в Na-ацетатном буфере с рН 4-5, например растворы с концентрациями, М: 1,03 ° 10>

3 ° 1О, 03 ° 10 3 l ° 1О-, 1 03-10 ;

Затем в каждом. растворе проводят реакцию с 0-метилгидроксиламином для получения соответствующих оксимов.

Для этого берут 2,9 мл приготовлеМных растворов ПЛ или ПЛФ соответст" 4> вующих концентраций и добавляют.

0,1 мл 0,3 М раствора 0-метилгидроксиламина. При этом получающиеся в результате разведения концентрации оксимов соответственно равны, М: . 50

1б,3.1а, 1О ; 3 10 ; 10 3.-10-, ; а концентрация 0-метилгидроксиламина в кювете 10 M. Реакцию проводят в темноте при 25 С. Спустя 30-40 мин . доводят рН раствора до 6-7 и измеря- 55 ют интенсивность флуоресценции при

450 нм и длине волны возбуждающего

: света 370 нм.,Полученные данные используют для построения калибровочных графиков.

Все растворы готовят на деиониэированной воде..

Используют ацетат натрия и гидроксид натрия марки "ОСЧ", уксусную и соляную кислоты, дополнительно перегоняют, хлоргидрат 0-метилгидроксиламина дважды перекристаллизовыва" ют,.

Пример 1. Готовят раствор, содержащий 6 ° 10 "М ПЛФ и 6 ° 10 М ПЛ.

Для приготовления такого раствора делают маточные, растворы пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфата с конI центрацией 10 М, из которых сначала разведением получают рабочие растворы с концентрацией веществ

10 М, а затем испытываемые.

Приготовление маточного раствора пиридоксаля.

Пиридоксаль гидрохлорид, МВ=203,5, Навеску пиридоксаля 20,4 мг помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до 100 мл деионизированной водой.

Приготовление маточного раствора пиридоксаль-5 -фосфата.

Пиридоксаль-5 -фосфат (кислота), МВ265,17. Навеску 26,5 мг помещают в мерную колбу. емкостью !00 мл и доводят .объем до 100 мл деионизированной водой.

Приготовление рабочих растворов

I пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфата (концентрация 10 М). — l мл маточного раствора пиридокI саля или пиридоксаль-5 -фосфата помещают в мерную колбу емкостью 100 мп и доводят до 100 мл 0,1 М Иа-ацетатным буфером с рН 5,0.

Приготовление испытываемого раствора.

В мерную колбу емкостью 100 мл выносят 6 мл раствора пиридоксаль-5 — " фосфата концентрации 10 М и 0,6 мл раствора пиридоксаля концентрации также 10" М (рабочие растворы).

Объем доводят до 10 мп 0,1 M Йаацетатным буфером с рН 5,0.

Приготовление маточного раствора

0-метилгидроксиламина концентрации

3 ° 10-2 М

О-Метилгидроксиламин, МВ 83,5.

Навеску 250,5 Mr помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до 100 мл 0,1 М Иа-ацетатным буфером с рН 4-5.

f I

Определение содержания пиридокI саля и пиридоксаль-5-фосфата в испытываемом растворе.

3 мл испытываемого раствора помещают s кювету и добавляют s него !

О мкл 3 ° !0 M раствора О"метилгид роксиламина в 0,1 M. Na-ацетатном буфере с рН 4-5. Раствор инкубируют в темноте в течение 40-50 мин при

25 С, Затем доводят рН раствора до

6-7 и измеряют суммарную интенсив-. ность фпуоресценции при 450 нм и длине волны возбуждающего света

370 нм,(Зэ,),в которую вносит вклад свечение О-метилоксима ПЛФ -.7, а также свечениеО-метилоксима ПЛ - 3>, образовавшегося в результате частичной трансформации ПЛ, т.е.:

:) =3 +о(З

5, где е — доля трансформированного

ПЛ, определяемая иэ графика (кинетика убыли относительной концентрации

ПЛ (I" et) во времени, кривая ПЛ ).

Через 50 мин (из графика)ef 0,065

Затем повышают концентрацию Ометилгндроксиламина в кювете до

10 1 M добавлением в кювету 2,5 мг

О-метилгидроксиламина, доводят рН раствора до 4-5, ннкубируют в темноте в течение 30-40 мин прн 25 С.

Через 30-40 мнн доводят рН анализируемой пробй до 6-7 и измеряют суммарную интенсивность флуоресценции при 450 нм н длине волны возбуждения 370 нм:

35 =3 43

В результате получают систему из двух уравнений с двумя неизвестными: в 3. i+3

В 1 2

3 =3+3 з1 1 2 решая которую, находят:

5 3

2 1-*

1 5 2

1

Величины 3 и 3< измеряют, значения ot. и 1-. а(находят из приве1!8901 Ь денного на чертеже графика (кривая

ПЛ ). По величине 3, из калибровочного графика для ПЛФ находят его концентрацию, а по величине 3 из ка2

5 либровочного графика для ПЛ находят концентрацию ПЛ.

Испытываемый раствор готовят три раза. Результаты испытаний приведены в табл.1, Значение с(определяют ,!0 по графику (см. чертеж ):

of 0,065; I -с(, =0,935. Концентрацию пирицоксаля и пиридоксаль-5 -фосфа1 та определяют по, калибровочным графикам. !

3 Пример 2. Готовят раствор, содержащий 6-10 8 М ПЛФ и 6.10 М ПЛ.

Маточные и рабочие растворы готовят аналогично примеру 1.

Приготовление испытываемого рас20 твора.

В мерную колбу емкостью 100 мл вносят 0,6 мл раствора пиридоксальI

5 -фосфата концентрации 10 М и б мл раствора пиридоксаля концентра. т ции 10 М (рабочие растворы). Объем доводят до 100 мл 0,,1 М Ма-ацетатным буфером с рН 5,0.

Определение содержания пиридоксаля и лиридоксаль-5 -фосфата,в исI пытываемом растворе.

3 мл испытываемого раствора помещают в кювету и добавляют в него

10 мкл 3 I,O 2M раствора 0-метилгндроксиламина в 0,1 М М а-ацетат35 ном буфере с рН 5,0. Далее повторяют все процедуры, описанные в соответствующем пункте, примера 1. Результаты испытаний приведены в табл.2.

Значения Ы определяют из графика на чертеже (cL =0,065; 1- о!= 0,935 ). Концентрации пиридоксаля и пиридоксаль-5 -фосфата определяют по калибровочным графикам.

Таким образом, предлагаемый спо45 соб по сравнению с известным является более простым и быстрым и позволяет надежно определять с точностью до IOX концентрации ПЛ и ПЛФ до 1О > М.

1118901

Таблица I

Пробы

С лФ. M/ë

Сд М/л

? -?

2,4 223,2 5,7 ° 10

2,4 238,) 6,05 ° 10

2,4 231,4 5,85 ° 10

Таблица 2

С„, M/ë oL Т

С„, М/л

Пробы

5 В

1 2 2

i 48,0 399,6 351,7 376,1 6,05.10 24,4

2 47,2 382,7 336,5 359,9 5 8 10 1 23 4

3 47,5 397,1 349,6 373,9 6,0 ° 10 24,3

Составитель В.Шкилькова

Техред О.Неце Корректор В.Бутяга

Редактор М.Петрова о

Тирах 822 Подпис но е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Заказ 7444/31 филиал ППП "Патент", г. Ухгород, ул. Проектная, 4

1 225,6 260,4 34,8 37,2 5,7 ° 10 8

2 2405 2753 348 37 2 57 ° 10 3 233,6 268,4 34,8 37,2 5,7. 10

Примечание: С „„=5,7 i I Î М/л;

С„ „= (5,87+0,12 )i I O М/л .

Примечание: С„„ (5,9510,10) IO М/л

СелФ (5,99Й0,05I ° 10 М/л.

23,6 6,0 10 8

238 606 10

23,2 5,9 il O a