Способ определения антигена

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА в биологической жидкости путем элект .рофоретического разделения исследуемой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки, инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию полос преципитации, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, разделение исследуемой жидкости проводят в наружном слое геля, затем в геле формируют канал и антисыворотку вводят в этот канал.

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(51) А 61 К 39/00

ГОСУДАРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬПЗФ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к автоияомм сеидкткльстам i (1 Вс (21) 3224162/28-13 (22) 10.10.80 (46) 23.03.85. Бюл. У 11 (72) Н.М.Синицына, А.Д.Шириков и И).В.Батков (53) 576.8.097(088.8) (56) 1. Иммунологические методы.;

Под ред. X.Ôðèìåëÿ. М., "Мир", 1979, с. 31-37.

2. Е.Englert, The proteins of human

ja11blаЫег bile with and without a11stones. Clinics Chimica Acta, g9 (1970), р. 319-331 (прототип) . (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА в биологической жидкости путем элект.рофоретического разделения исследуемой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки, инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию полос преципитации, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности определения, разделение исследуемой жидкости проводят в наружном слое геля, затем в геле формируют канал и антисыворотку вводят в этот канал. вносят исследуемую биологическую жидкость, которую наслаивают на поверхность гелевой колонки по капилляру, прибор заполняют буферными растворами, подводят напряжение и проводят разделение исследуемой биологической жидкости.

После проведения разделения, гель извлекают иэ разделительной камеры для проведения реакции иммунодиффузии. Для этого разгерметизируют конец капилляра и извлекают его.

В сформированный канал вводят антисыворотку. Гель в вертикальном положении оставляют на 12-24 ч для осуществления иммунодиффуэии и затем

/ внутри геля выявляют четкие линии преципитации, соответствующие фрак.циям антигена.

Для идентификации линий преципитации и более четкого их выявления гелевые колонки можно окрасить специфическими красителями.

Пример 2. Для ускорения реакции иммунодиффузии канал в. колонке полиакриламидного геля после проведения диск-электрофореза заполняют агаром с иммунной сывороткой, колонку помещают в буферный раствор для электрофореза, например трисглицериновый буфер РН 8,6, через который пропускают перпендикулярно гелевой колонке электрический ток силой до 60-90 мА. Время диффузии сокращается до 30 мин.

Агар с иммунной сывороткой готовят следующим образом.

Агар варят в .буферном растворе до получения прозрачной однородной массы. Применяют 1,5Х-ный гель агара. В остуженный до 50 С агар доо

40 тщательно перемешивают и заливают канал. антисыворотку.

Пример 3. Выявление локализации иммуноглобулинов сыворотки

Путем гомогенизации ткани печени с последующим центрифугированием галогената получают фракцию растворимых мембранных белков ткани печени. Затем определяют их титр в рациальиой иммунодиффузии по Манчини.

1 1146051 1

Изобретение относится к .иммунологии и касается способа определения антигена.

Ивестен способ определения антигена в биологической жидкости с 5 помощью реакции преципитации в лунках j1) .

Известен также способ определения антигена в биологической жидкости путем электрофоретического разделения 10 исследуемой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки в лунки по сторонам геля, инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию по- 15 лос преципитации (2) .

Однако известные способы не обеспечивают высокой точности определения., Целью изобретения является повы- 20 шение точности определения.

Эта цель достигается тем, что согласно способу определения антигена в биологической жидкости путем электрофоретического разделения исследуе- 25 мой жидкости в колонке с гелем с последующим введением антисыворотки, инкубированием реакционной системы и учетом результатов по наличию полос преципитации, разделение иссле- 30 ,. дуемой жидкости проводят в наружном слое геля, затем в геле формируют канал и антисыворотку вводят в этот канал.

Пример 1. Разделительные камеры для диск-электрофореза

35 (стеклянные трубочки) герметизируют с нижнего конца, установив их вертикально в подставке для полимеризации.

Затем берут стеклянный капилляр, на 10-20 мм длиннее разделительной бавляют 1-10%- иммунной сыворотки, камеры, диаметром 1-2 мм, Герметик эируют один из концов капилляра, затем его вводЯт внУтрь Разцелительнои Вместо агарового геля для заливкамеры герметизированным концом вверх, не доводя его до конца камеры на 5-10 мм. Капилляр и разделительная камера располагаются соосио.

Капилляр укрепляют в этом положении, оставлЯЯ открытым отвеРстие Разце- крови, специфичных к Растворимым

50 лительиой камеРы, чеРез которое вве- мембранным белкам клеток печени. ден капилляр.

Разделительн5 ю камеру заполняют растворами сомономеров, из которых полимеризуется акриламидный гель.

После полимеризации геля разделительную камеру укрепляют в приборе для вертикального электрофореэа, в нее

Составитель Г.Смирнова

Редактор О.Черниченко Техред Л.Микеш Корректор М.Леонтюк

Заказ 1253/6 Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 11

Для этого готовят 10 порций 17.-ного агарового геля и вносят в него выделенную фракцию белков в разведении 1: 100-1: 10. После полимеризацин геля в нем формируют лунки, диаметр которых равен диаметру канала в полиакриламидной гелевой колонке (пример 1). В каждую лунку вносят по 0,05 мл сыворотки крови обследуемых больных и инкубируют до момента окончания иммунодиффузии, при этом титр фракции мембранных белков выбирают таким, чтобы в реакции радиальной иммунодиффузии диаметр кольца преципитата не превышал диаметр колонки полиакриламидного геля.

Монтируют устройство для электрофореза в геле, разделяют образцы сывороток крови объемом по 0,05 мл и формируют канал в геле по примеру

1. После этого в канал гелевой колонки вносят фракцию растворимых мембранных белков в необходимом титре и ннкубируют колонки до по- явления полос преципитации.

Гелевые колонки с зонами преципитации подвергают денситометрированию. При этом, по предлагаемому способу на денситомограмме зона локализации искомых иммуноглобулинов

46051 4 характеризуется ьдногорбным пиком, основание которого идентично длине фракции искомого иммуноглобулина, а высота пика пропорциональна его концентрации. При определении антигена по известному способу с пос. ледующей денситометрией преципитата, характер кривой двугорбый, так как прямой сканирующий луч света при

1р денситометрии пересекает дугу ре,ципитации дважды, поэтому двугорбая кривая не отражает точной локализации искомого антигена в геле и не характеризует его концентрацию.

При сравнительной оценке точности предлагаемого и известного спосо бов и на примере десяти образцов сы» вороток крови больных выявлено, что по предлагаемому способу точная локализация искомого белка определяет ся в десяти случаях, тогда как по известному способу точное определение локализации белка получено в шести, удовлетворительное в двух и неудовлетворительное в двух случаях.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения антигена, что в свою очередь позволяет повысить качество диагностики заболеваний.