Способ определения жизнеспособности тканей

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ путем инкубации ткани в присутствии Кребс-Рингербуфера , глюкозы и смеси аминокислот, выделения суммарных белков и измерения включения в них аминокислот, отличаю-щийся тем, что, с целью повышения точности определения, проводят параллельно инкубацию ткани в среде, содержащей дополнительно инсулин в концентрации 10 -10 М, а о жизнеспособности тканей судят по разности между включением С }аминокислот i в присутствии инсулина и без него, причем жизнеспособностьткани сд пропорциональна степени сохранения величины этой разности.

ÄÄ SUÄÄ I 172511

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)4 А 01 Я 1 02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (Н ABTOPGKOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3642727/28-13 (22) 12.09.83 (46) 15.08.85. Бюл. М 30 (72) В.А.Чуйко (7!) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (53) 612.013+577.21(088.8) (56) Гулевский А.К., Чуйко В.А., Калько А.И. Биосинтез суммарных белков в срезах щитовидной железы при замораживании (-196 С ) — оттаивании (+37 С ), — В сб. "Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины", Киев, "Наукова думка", 1974, с.45-47. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕН1И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ путем инкубации ткани в присутствии Кребс-Рингербуфера, глюкозы и смеси P+С g

f аминокислот, выделения суммарных белков и измерения включения в них (С аминокислот, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повыщения точности определения, проводят параллельно инкубацню ткани в среде, содержащей дополнительно инсулин в концентрации 10 -10 И, а о жизнеспособности тканей судят по разности между включением p" С1аминокислот в присутствии инсулина и без него, причем жизнеспособность-ткани пропорциональна e åïåíè сохранения величины этой разности.

1172511

Йэобретение относится K медицине и биологии и может быть использовано при определении жизнеспособности тканей, предназначенных для консервирования и трансплантации. 5

Целью изобретения является повышение точности определения жизнеспособности тканей.

Пример (таблица), Срезы незамороженной щитовидной железы весом 25 r, хранившейся 60 мин, поместили в I мл инкубационной среды, состоящей из Кребс-Рингер-бикарбонатного буфера, 0,005 г глюкозы и

1 мк Кюри смеси С вЂ” аминокислот, 15 инкубировали в течение 60 мин при

37 С в атмосфере 95X Q и 5X CO> .

Параллельно проводили инкубацию другого образца ткани, но при этом в состав среды инкубации дополни- N тельно ввели инсулин в концентрации

5 10 М. После окончания инкубации реакцию останавливали помещением образцов на ледяную баню. Затем добавляли равный объем 20%-ной три- 25 хлоруксусной кислоты. Полученную суспензию нанесли на фильтры Сынпор" (диаметр 0,4-0,6 мм ). Осадки трижды промыли 8 мл охлажденной трихлоруксусной кислоты, смесью спиртхлороформ (1:1), 70 и 96 этиловым спиртом. Фильтры высушили на воздухе, поместили в 10 мл толуольного сцинтил- лятора и просчитали .х радиоактивность на счетчике St -IÎÎ (Франция ).

Радиоактивность пробы (контрольная, неэамороженная щитовидная железа ) составила 591,33+82,69 имп./мин/мл белка.

Радиоактивность пробы с добавлени- ем инсулина составляла 1558,0 1

159,95 имп./мин/мл ткани. Разница между этими показателями составляла

956,67 имп./мин./мп белка.

В аналогичных условиях определяли радиоактивность щитовидной железы, замороженной со скоростью 100 /ìèí без криопротектора до -196 С. Радиоактивность образцов щитовидной железы, жизнеспособность которых оценивали известным способом, составила

292,0 28,0 имп./мин/мл белка. Если ,выразить эту величину в процентах по отношению к контролю (таблица,2) который составляет 59I,33+82,69 имп./мин/мл белка,то она составит 50%.

Параллельное исследование радиоактивности образца, которое производили после добавления в среду инкубации инсулина, показало, что данная величина составляет 287 57,5 имп./ мин/мл белка. Поскольку разница показателей, полученных с помощью предлагаемого способа и известного, равнялась О, то отношение величины, составляющей эту разницу, к контролю (таблица ) также равняется О. Следовательно, согласно предлагаемому способу оценки жизнеспособности, данный показатель для щитовидной железы, замороженный до -196 С без применения криопротектора, составляет

О.

Дополнительный анализ микроскопического строения аллогенных трансплантантов щитовидной железы, изъятых на 20-е сутки после пересадки, выявил только в 2-х образцах из 10 (207) сохранение на периферии участков фолликулярных клеток. В остальных случах фолликулярная структура тиреоидных трансплантантов не сохранилась и наблюдалось ее замещение соединительно-тканевыми элементами.

Щитовидную железу замораживали со скоростью 6 5 /мин до -196 С в присутствии 12,57. ДАССО-(Таблица, 3).

Анализ жизнеспособности этих образцов щитовидной железы, проведенной известным способом, показал, что указанный показатель составляет 50%.

В аналогичных условиях производили определение жизнеспособности щитовидной железы предлагаемым способом.

Согласно полученным данным жизнеспособность составляла 20,27.

Анализ микроскопического строения аллогенных трансплантантов щитовидной железы, консервированных указанным выше способом показал, что в

3-х образцах из 10 Сохранилось значительное количество участков фолликулярных клеток °

Определяли жизнеспособность щитовидной железы, консервированной с

12,57. ДИСО со скоростью 1 /мин до

-196ОС.(Таблица, 4 ). Жизнеспособность консервированной ткани, оцененной известным способом, составляла 107%, а предлагаемым 70,47.

Проведенное изучение морфологического строения трансплантантов щитОвидной железы, консервированных указанным выше способом, позволило установить сохранение в 7 случаях

172511 способом чаев.

Приведенные примеры показыйают, что предлагаемый способ позволяет с более высокой точностью определять жизнеспособность ткани, поскольку он предусматривает определение не только степени сохранения функциональной активности ткани, но и оценку ее способности к репарации структурно-функциональных повреждений.

Сравнительная оценка хиэиеспособиости консервированной щитовидной хелеэы, проведенная известным способом и предлагаемым

Предлагаемый способ: включение мC-аиинокислот в суммарные белки под влиянием инсулина, нмп./мип/мг белка

Жизне

ЖиэнеспособазниИзвестный способ: включение Саминокислот в суммарные белки, имп./мии/мг белка

Условия эксперимента способа меху покаател ими ность, определяемая ность, определяемая иэвестным спо собам, 2 предпа гаемым спосо бома та цитовидной хелезы ) 1 Щитовидная нелеsa= контроль 591,33+82,69

I558iOf 1 59,95 956 67

2 Заморахиваиие з! 00/ мин до

-196ЯС беэ криопротектора 292,0228,0

Фолликулярное строение сохраняется в l образце

0 иэ 10 (102) 50Х 287,5257,5

3 Заморахнвание с 12 SX

ДМСО до 196oC

Фолликулярное строение сохраняется в 3-х случаях из

l0 (30Х) 193,69 20,2

50Х 493,33551,6

299,64158,77

4 Заморахнвание 1 /мин с 12,5Х ДИСО до -196 С 637,67+ 123,0

Фоллик улярное строение сохраняется в 7 случаях из IO (702 )

100Х

I3I1,33+169 83

673,66 70,4

3 1 из 10 фолликулярного строения транс- плантантов.

Таким образом, данные о жизнеспособности криоконсервированной щитовидной железы, полученные известным способом, только в одном из 3-х случаев (таблица, 4 ) приблизительно совпадали с результатами, полученными при изучении микроскопического строения трансплантантов, а данные, полученные предлагаемым

4 в трех из 3-х слузнеспобность ределяая с поЗ1ЬЮ ДОПОЛ. тельного особа (опделение икроскопнского роения анспланта