Способ получения растворимой фракции костных клеток

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОЙ ФРАКЦИИ КОСТНЫХ КЛЕТОК, включающий охлаждение смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, костную ткань животных центрифугируют сначала при 12- 15 тыс. g в течение 5-10 мин, а затем при 24-28 тыс. g в течение 50-60 мин при О-4°С.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (Я)4 А 61 К 35/32

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3679483/28-13 (22) 26.12.83 (46) 30.08.85. Бюл. № 32 (72) Б. Я. Власов, П. Ф. Переслыцких и Л. А. Сысоев (71) Иркутский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии и Институт физиологии и биохимии растений

СО АН СССР (53) 615.361.71 (088.8) (56) Любимова Н. В. Фракционирование биологических экстрактов на мембранных фильтрах. — В кн: Биохимические методы.

М.: Наука, 1980, с. 25.

Слуцкий Л. И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. М.: Медицина, 1969, с. 20.

ÄÄ SUÄÄ 1175481 A (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОPHMOA ФРАКЦИИ КОСТНЫХ КЛЕТОК, включающий охлаждение смеси, отличаюи»ийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, костную ткань животных центрифугируют сначала при 12—

15 тыс. g в течение 5 — 10 мин, а затем при 24 — 28 тыс. g в течение 50 — 60 мин при 0 — 4 С.

1175481

Составитель В. Каюкова

Техред И. Верес Корректор И. Муска

Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и о1 крытии

113035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор И. Рыбченко

Заказ 5247I6

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к биохимии, и может быть использовано для изучения активности ферментов и их комплексов, например системы гликолиза, в растворимой фракции костной ткани.

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта.

Пример 1. Бедренная кость крысы, механически очищенная от периоста, мышц, сухожилий, вес пробы 0,141 г, холодовая комната 0 — 4 С. Пробу фиксируют во фторопластовой кювете и помещают в центрифужную пробирку, которую вставляют в предварительно охлажденный до 2 С ротор центрифуги ЦЛР-1. На пробу воздействуют гравитационным полем величиной 13 тыс. g в течение 7 мин при 0 — 4 С. При этом жесткий каркас кости освобождается от сопутствуюгцих клеточных элементов (клеток крови, костного мозга), о чем свидетельствует следовая активность каталазы в очищенной пробе как маркера загрязняющих клеток. Затем очищенную пробу снова фиксируют во фторопластовой кювете и помещают в пробирку, содержащую около 1 мл 0,25 М сахарозы, 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,40, измеренный прецизионным рН-метром фирмы

«Радиометр»), 0 001 и ЭДТА. При этом нижний край пробы соприкасается с поверхностью раствора. Затем пробу центрифугируют и той же центрифуге при 26 тыс ° g

55 мин при 0 — 4 С. После остановки ротора в буферном растворе определяют активность ЛДГ спектрофотометрически по изменению оптической плотности при 340 нм.

Для 0,4 мл анализируемой пробы (соответствует 0,062 r костной ткани) изменение оптической плотности при 340 нм (ЛЕз4о)составляет за 3 мин 0,080. Активность фермента (выраженная величиной изменения оптической плотности в мин на грамм влажной ткани) 0,430 ед. Оставшуюся часть пробы используют для выявления возможного загрязнения растворимой фракции другими фракциями клетки. Загрязнения растворимой

10 фракции маркерными компонентами других фракций не обнаружено.

Пример 2. Бедренная кость крысы, вес

0,145 г. Образец кости обрабатывают как в примере 1 в холодовой комнате при

0 — 4 С. Первое центрифугирование проводят

15 при 12 тыс. g в течение 5 мин при 0 — 4 С. о

Активность каталазы как индикатора загрязнения костной ткани следовая. Второе центрифугирование проводят при 24 тыс. g в течение 50 мин при 0 — 4 С. Активность ЛДГ, 2р определенная в буферном растворе описанного состава, 0,408 ед. Загрязнения растворимой фракции мембранными фракциями не обнаружено.

Пример 8. Бедренная кость крысы, вес пробы 0,140 г. Образец кости обрабатывают как в примере 1, в холодовой комнате при 0 — 4 С. Первое центрифугирование проводят при 15 тыс. g в течение 10 мин при

0 — 4 С. Активность каталазы в очищенной пробе не определяется. Второе центрифугирование проводят при 28 тыс. g в течение

60 мин при 0 — 4 С. Активность ЛДГ 0,500 ед.

Загрязнения растворимой фракции другими компонентами не обнаружено.