Способ получения диагоностического флуоресцирующего гриппозного иммуноглобулина

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ СИИ Х

РЕСПУБЛИК

0% (И) (51)4 А 61 В 10 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

II АВТО СНОМЪ СВМДЕТНВСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3728252/28- I 4 (22) 18.04.84 (46) 15. 10. 86. Бюл. II 38 (7! ) Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа и Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин н сывороток (72) Л.Е . Камфорнн, Н.А. Медведева, Л.Б. Потапенко и Б.И. Фейгельман (53) 615.373 (088.8) (56) Шкваржнл Ф., Фрагнер И. Наш опыт с приготовлением животных антиглобулинов, меченных флуоресцеинизотиоцианатом. Журнал гигиены; эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Прага: 1965, с. 9, М 4, сз 459-467. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧКНИЯ ДИАГНОСТИЧКСКОГО ФЛУОРЕСЦИРУЕЩЕГО ГРИППОЗНОГО

ИИИУНОГЛОБУЛИНА путем последовательной обработки нротивогрнппозной сыворотки риванолом, сульфатом аммония с последукщей очисткой и коньюгацией с флуорохромом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения способа и повышения выхода конечного продукта, очистку проводят обработкой XgG 6-8Х-ным раствором хлористого натрия, а конъвгацию осуществляют в течение 1-3 ч при 18-26 С.

Составитель Т. Козлова

Техред А.Кравчук Корректор О. Луговая

Редактор Т. Якова юМ

Заказ 5588/2

Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делаи изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

Ф 12

Изобретение относится к иедицине, в частности иимунологии, и может быть использовано в вакционно-сывороточнои деле при производстве флуоресцирующих антител для экспрессдиагиостики гриппа.

Целью изобретения является ускорение способа и повышение выхода конечного продукта.

Способ поясняется следующим примероие

К 0,3Х-ному водному раствору риваиола при иостояинои перемешивании добавляют сыворотку кролике, иииуниув к вирусу гриппа А{НЗИ2) и имеющув специфический титр в PTFA 1/640.

На 500 ип растворе риванола берут

100 ип сывбротки. Через 1 ч после добавления сыворотки рй смеси доводят раствором едкого натрия до 7,1 и выдерживают в течение 15 ч при

0 С, при этом выпадает плотный оса док ельбумииа. Недосадочную жидкость, содержащую глобулины, отделяют цеитрифугированием в течение

ЗО иии ири факторе разделения Р

1000.

Для очистки глобулина от риванола в иадосадочнув жидкость добавляют

П хлористого натрия. После 30 мин переиешивания осадок отделяют фильтрованием через буиажный фильтр.

Профильтрованный раствор охлаждают до 4 С, после чего в него добавляют равный объеи насыщенного раство- ра сернокислого аммония и выдерживают при той же температуре в тече" иие 12 ч. Осадок отделяют центри-фугированиеи s течение 45 мин при

Р * 250Î, а затеи разводят забуференным физиологическим раствором уИ 7,2 до объема, равного 1/3 исходного объема сыворотки, что составляет 33 мл.

Очистку выделенного Х86 осуществляют гельхроиатографией на колонке с сефадексом 0-25 при помощи аб18513 3 сорбциометра. Для дальнейшей работы отбирают фракции IgG максимального светопоглощення при длине волны

280 нм. Всего собирают 807 иммуноглобулинов, иммунологнческая активность которых в РТГА с гомологнчным антигеном составляет 1/640. По результатаи электрофоретического контроля установлено, что вьщеленная

10 фракция не содержит других сывороточных белков., кроме IgG, при этои концентрация белка в собранном растворе составляет 2,4 об.X.

В полученный раствор добавляют

0,5 М карбонатный буферный раствор до рН 9,3.

Операцию конъюгации IgG с флуоресцеиннзотноцианатом (ФИТЦ), используемым в качестве флуорохрома для

2р метки иммуноглобулина, проводят добавлением 24 мг ФИТЦ к 50 мл

2,4X-ного раствора IgG. Смесь выдерживают в течение 2 ч при 22 С.

Полученный конъюгат подвергают

2э очистке от несвязавшегося ФИТЦ на колонке с гелем сефадекса С-50.Ïoñле этого производят фракционирование меченых иимуноглобулинов на

ДЕАЕ-целлюлозе по известной метоЗО дике

В конъюгат вносят консервант—

1Х-ный раствор мертиолята натрия в соотношении 1: 10000, заморажнвают до -20 С и лиофйлиэирувт.

В данном примере получают фпуоресцирующий иииуноглобулин с о6ратным красящим титром, равным 32, н обратным титром неспецифической активности, равным 8.

Таким образом, за счет сокращения экспозиции прн проведении конъюгации происходит ускорение способа в 10 раз (2 ч против 20 ч по прототипу) н повышение выхода конечного

4 продукта за счет повышения красящего титра в 4 раза (16-32 против 4-8 по прототипу).