Способ получения днк-полимеразы- @ из ядер печени крыс

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН

„.Я О„„д 2ДД2Я (511 4 А 61 К 37/18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

3/

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н ABTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3767448/28-14 (22) 06.07.84 (46) 23.05.86. Бюл. Р 19 (7 1) Ленинградский институт ядерной фиэики им. Б.П.Константинова (72) Н.В.Белякова и В.М.Крутяков (53) 615.45-547.965(088.8) (56) Haines М.Е., Mikremdsinghe R.G., Johnston J.R. Purification and

partiaI, characterization of rat fiver nucEear DNA. pofimerdse. - European J. of Biochemistry, 1972, ч. 31, N 1, р. 119-129. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНЧЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ- Р ИЗ ЯДЕР ПЕЧЕНИ КРЫС с помощью хроматографии и центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью упрощения и стабилиэации получаемого препарата, ядра печени крыс обрабатываются 1Х-ным раствором тритона Х-!00, экстрагируют

0,.3 М раствором. хлористого натрия, очищают от примесей хроматографией на ДЕАЕ сефадексе А-25 и осаждением сульфатом аммония при 50Х-ном насыщении, высаливают сульфатом аммония при 80Х-ном насыщении, подвергают гель-фильтрации на сефадексе 675 и обрабатывают гидроксилапатитом.

25

ll 123

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимическим способам очистки белков.

Цель изобретения — упрощение способа и стабилизация получаемого препарата за счет сокращения количества этапов и присутствии сопи высокой концентрации.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают хроматин из печени крыс.

Экстракт хроматина используется для извлечения целевого продукта. Очищают целевой продукт от примеси нуклеиновых кислот путем хроматографии на колонне с ДЕАЕ сефадексом А«25 в

0,3 М NaC1. Очищают от примесных белков фракционируют белки сульфатом аммония; .очищают целевой продукт от белков путем гель-фильтрации на сефадексе G-75; очищают целевой продукт от примесей нуклеаз с помощью обработки элюата гидроксилапатитом, Hp и м е р. Ткань печени крыс любой породы, пола и возраста (60 r) измельчают ножницами и гомогенизируют.в стандартном лабораторном (отечественном) гомогенизаторе при

8000 q в 560 мл среды, состава:

0,25 М сахароза, 5 mM трис-НСl,рН7,8;

1 шМ ЭДТА и 3 mM МЕС1,,после чего фильтруют через 8 слоев марли. Получают 600 мл гомогената. Гомогенат центрифугируют при 2000 q 15 мин.

Супернатант отбрасывают. Осадок ядер один раз промывают в 200 мл той же

qpåäû. Отмывка состоит в следующем.

Осадок ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в слабо притертом гомогенизаторе Даунса (стекло/стекло).

Затем центрифугируют при 2000 q 5 мин.

Промывную среду отбрасывают. Осадок ресуспендируют тем же способом в

50 мл среды для гомогениэации.

К ресуспендированным в среде для гомогенизации ядрам прибавляют при постоянном перемешивании стеклянной палочкой равный объем 1Х-ного раствора тритона Х-100 в той же среде и осторожно (чтобы не разрушались ядра) перемешивают в течение 1 мин. Затем центрифугируют при 6000 10 мин и супернатант отбрасывают.

Осадок ресуспендируют в 100 мл среды состава: 1Х-ный тритон Х-100, 10шМ трис-НС1, рН 8,0; 2шМ ЭДТА и гомогениэируют 15 раз в гомогенизаторе Даунса, после чего центрифуги2261 2 рунт при 6000q 10 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок представляет собой хроматин, который ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в гомогенизаторе Даунса в 100 мл буфера состава: 10 mM трис-НС1, рН 8,0.

Хроматин в течение 30 мин экстрагируют в соотношении 1:5 по объему в среде состава: 0,3 М НС1, 10 М трис-НС1, рН 8,0 в гомогенизаторе

Даунса. Затем центрифугируют при

6000q 10 мин. Осадок отбрасывают.

Супернатант используют для дальнейшей очистки целевого продукта из хроматина.

Колонку объемом 50 мл с отношением диаметра к высоте 1:4 уравновешивают средой состава: 0,4 М NaC1

10mM трис-НС1, рН 8,0. Экстрат хрома20, тина пропускают через колонку. При этом отбрасывают элюирующий буфер, составляющий "свободный объем" колонки и равный 1/3 объема набивки, После этого собирают объем злюата, равный объему нанесенного препарата. К препарату, полученному после хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-25, добавляют прн смешивании за 30 мин сульфат аммония до 50 -ного насыщения..

Перемешивают 30 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 6000 q и осадок отбрасывают. К супернатанту прибавляют сульфат аммония до концентрации 80Х насыщения и оставляют до утра. Затем центрифугируют при 6000 q

30 мин. Осадок< растворяют в 20 мл буфера состава: 1 М ИаС1, 1ОХ-ный глицерин, 10mM трис-НС1, рН 8,0. Супернатант фильтруют на вакуумном отсосе через миллипоровый фильтр

It (!

Сынпор-2 . Осадок с фильтра объединяют с осадком после центрифугирования.

Колонку объемом 1000 мл (отношение диаметра к высоте 1:300) уравновешивают буфером состава: 1 М NaC1, 10Х-ный глицерин, 10mM трис-HCl рН 8,0. Полученный осадок наносят на колонку и элюируют со скоростью

50-30 мл/ч. Отбрасывают первые 45Х элюата (Х от общего объема колонки) и собирают последующие 15Х элюата.

Стадию выполняют беэ определения ферментативной активности. Элюат диализируют от NaC1 к буферу состава:

20mM КН, РО@, 10Х-ный глицерин, рН 7,5.

К отдиализованному элюату в стакане добавляют 10-15 мл гидроксилапа12322

Актив- Выход (обность, щая активед/мг ность), ед.

Концентр. Всего белка, белка, мг/мл мг

Объем, Фракция по ходу выделения

Гомогенат печени 600

26 !5600 О 0075 117

Экстракт хроматнна в 0,3 М NaC1

90 1,1

Сульфат аммония

50-807.-ного на50 0,375

2,5 сыщения

Хроматография на сефадексе G-75

4 35,0

2 500

200 0,02

20 0,10

Гидроксилапатит

100

Составитель М.Позняк

Редактор Е. Папп Техред И.Попович Корректор Л. Пилипенко

Заказ 2722/6 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тита и в течение 30 мин перемешивают.

Затем центрифугируют при 6000 q 5 мин.

Супернатант отбрасывают. Осадок ресуспендируют в 25 мл буфера состава:

70mM КН РО, !О -ный глицерин,рН 7,51

10 .мин перемешивают и центрифугируют при 6000 q 5 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок отмывают таким же образом, тем же буфером еще два раза.

При этом -полимераза не смывается с гидроксилапатита. Осадок после третьей отмывки ресуспендируют в

20 мл буфера состава: 300mH КН РО,1., 10Х-ный глицерин, рН 7,5; перемешивают 30 мин, центрифугируют при

6000 q 5 мин. Супернатант представляет собой препарат -полимеразы.

Фермент хранят в 507-ном глицерине, О,! М NaC1, 0,05mM трис-HCI, рН 8,0 при 20ОС. Препарат сохраняет свою активность в течение 6 мес.условия хранения значительно проще (темо пература 2О С, отсутствуют растворы, загрязняющие препарат}.

В таблице представлены реэульта- д ты очистки целевого продукта на раз61 4 личных стадиях. Из сопоставления значений первой и последней стадий видно, что активность возрастает с

0,0075 до 50,0 ед, на 1 мг-белка. Выход целевого продукта по общей ферментативной активности составляет

80Х.

За 1 единицу активности фермента принимают количество фермента, катализирующего включение в ДНК 1 нТ моль общего НТФ эа 1 ч при 37 С в оптимальных условиях инкубации.

В известном способе достигается очистка целевого продукта в 800 раз по сравнению с ядрами из гомогената печени.

Упрощение способа происходит за счет сокращения количества этапов (известный способ — 10, предлагаемый — 7), времени выделения конечного продукта в результате отсутствия длительных этапов диалиэа и многочасового высокоскоростного центрифугирования.