Способ консервации иммобилизованных ферментов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Реслублик ав943280 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.05.78 (21) 2620877/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 15.07.82, Бюллетень НВ 26 (511М. Кп.э

С 12 N ll/00

А 61 K 37/48

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий

133) УДК577. 15. . 07 (088. 8) Дата опубликования описания 15.07.82

Л. В.Козлов, Ю.И.Крылова, Л.В.Кудряв ева и В.И.Суровцев

1 "Y ltA

°:1 i !

4 :J,"g

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемяки (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ ИММОБИЛИЭОВАННЫХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способам консервации иммобилизованных ферментов, позволяющим избежать существенной потери активности при длительном хранении,н транспортировке промышленно изготовленных препара-. тов иммобилизованных ферментов.

Способ консервации может найти широкое применение при изготовлении препаратов иммобилизованных ферментов для использования их в пищевой, химической и микробиологической промышленности.

Известно, что для длительного хранения белков и ферментов используют лиофильное высушивание, которое в большинстве случаев обеспечивает стопроцентное сохранение активности и нативностн препаратов. В случае потерь активности при лиофилизации в раствор фермента перед высушиванием добавляют различные инертные наполнители, растворимые в воде (1).

Лиофильное высушивание иммобилизованных ферментов также широко применяется для получения форм препаратов, выдерживающих длительное хранение, однако часто сопровождается частичной потерей активности.

Наиболее близким к предлагаемому является способ консервации июаобилизованных ферментов путем лио5 фильного высушивания суспензии иммобилиэованного фермента, в частноСти пепсина, в воде или буфере, который имеет тот недостаток, что s зависимости от использованного для иммобилизации носителя, при высушивании теряется от 10 до 903 активности (2).

Цель изобретения — уменьшение потерь активности фермента при высушивании.

Цель достигается тем, что согласно способу консервации иммобилизированных ферментов путем лиофольного высушивания их суспензии в воде или буфере, у суспензии добавляют инертный раствориьый наполнитель при соотношении фермент:наполиитель

1:(1-20) .

В качестве инертного наполнителя используют неорганические соли, например поваренную соль.

В качестве инертного наполнителя используют аминокислоты, например глицин.

943280

Перед последующим использованием фермента наполнитель может быть легко удален отмыванием буфером или центрифугированием.

Пример 1. 20 мг пепсина свиньи, иммобилизованного на аэросиле, суспендируют в 1 мл воды, содержащей инертный растворимый наполнитель в весовом соотношении к препарату иммобилизованного фермента от 1:1 до 20:1. Смесь-лиофильно высушивают.

Перед использованием .препарат суспендируют в 0,01 М ацетатном буфере, рН 4,5 и удаляют наполнитель путем отмывания буфером на колонке или с помощью центрифугирования. Активность препаратов, определенная по гемоглобину в качестве субстрата, приведена ниже в виде процентного отношения активности лиофильно высушенных препаратов к активности исходного препарата до лиофилизации:

Без наполнителя 9

С глицином в соотношении 10.:1 16

20:1 25

С глюкозой в соотношении 1:1

10:1

С сахарозой в соотношении 1:1 44

20:1 63

С поливинилпирролидоном (МВ 25000) 1:1

10:1

С декстраном .(МВ 500000)

1:1 25

67

В качестве инертного наполнителя используют углеводы, например глюкозу, сахарову.

В качестве инертного наполнителя используют водорастворимые полисахариды, например декстран.

В качестве инертноГо наполнителя используют полиспирты, например полиэтиленглнколь.

В качестве инертного наполнителя используют водорастворимые синтетические полимеры, например поливинилпирролидон.

Перед высушиванием к суспензии иммобилизованного фермента в воде или буфере добавляют инертный растворимый в воде наполнитель, который предохраняет препарат иммобилизованного фермента от потери активности при лиофильном высушивании и легко может быть удален перед использованием препарата иммобилизованного фермента путем отмывания водой.

Препараты иммобилизованных ферментов сохраняют активность, превышающую в несколько раз (в ряде случаев в 8 раз) активность препаратов, подвергнутых лиофильному высушиванию без наполнителя.

100

Формула изобретения

1. Способ консервации иммобилизованных ферментов путем лиофильного

45 высушивания их суспензии в воде или буфере, отличающийся тем, что, с целью уменьшения потери активности фермента при высушивании, к суспензии добавляют инертный растворимый наполнитель при соотношении фермент:наполнитель 1:(1-20).

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве инертного наполнителя используют неорганические соли, например поваренную соль.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве инертного наполнителя используют аминокислоты, например глицин.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й. с я тем, что в качестве инертного наполнителя используют углеводы, например глюкозу, сахарозу.

5. Способ по п.1, о т л и ч а ю65 шийся тем, что в качестве инерС полиэтиленгликолем (МВ 3000) 1г1 78

С Nace в соотношении 1:1 21

10:1 31

20:1 35

П р и м .е р 2. 20 мг куриного пепскна, иммобилизованного на диатомите, консервируют аналогично иммобилизованному пепсину свиньи.

Активность по гемоглобину лио-!

О фильно высушенных препаратов, 3:

Без напблнителя. 5Э

С глицином в соотношении 1:1 60

10:1 67

Пример 3. 20 мг протосубтилина, иммобилизованного на сфероне

АгА 1000, суспендируют в 1 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 8,0 и консервируют аналогично консервации иммобилизованного пепсина. Активность лиофильно высушенных препаратов по гемоглобину, Ъ:

Без наполнителя 80

С глюкоз ой в сост ношении 1г1

С полиэтиленгликолем (MB 3000) 86

Пример 4. 20 мг протосубтилина, иммобилизованного на энзакриле АА, консервируют аналогично консервации протосубтилина, иммобилизованного на сфероне. Активность лиофильно высушенных препаратов по гемоглобину, %:

Без наполнителя 74

35 С глюкозой в соотношении 1:1

С полиэтиленгликолем (МВ 3000) 1:1 93

943280

1. Патент США В 3133001, кл. 195-68, опублик. 12 ° 05 ° 64.

Составитель О. Скородумова

Редактор Н.Киштулинец Техред Ж. Кастелевнч Корректор H.МУска

Заказ 5037/34 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

«В

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тного наполнителя используют водорастворивые полисахариды, например декстран.

6. Способ по п.l о т л и ч а юшийся тем, что в качестве инертного наполнителя используют поли- 5 спирты, например полиэтиленгликоль.

7. Способ по н.l о т л и ч а юшийся тем, что в качестве инертного наполнителя используют водорастворимые синтетические полимеры, 10 например поливинилпирролидон.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2. Крылова 10.И., Козлов Л.В., Антонов В.К. Ганна Б.С., Датунашвили

E.Н., Павленко Н.М. Иммобилизация кислых протеинаэ. - Биоорганическая химия, 1976, вып.2, с.273 (прототип).