Способ получения рекомбинантной днк,содержащей ген, кодирующий амилазу

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИ Х

РЕСПУБЛИН (192 (Н) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3244760/30-15 (22) 13,02.81 (31) 8011842 (32) 10.04.80 (33) GB (46) 23.05.86. Бюл. )i - 19 (71) СПС Интернэшнл Инк (US) (72) Чарльз Энтойн Кольсон, Пирр

Эмил Корнелис, Колетт Симон Дигнефф

Рауль Г. П. Валон и Коррине Балон(ВЕ) (53) 575.2.23:576.8(088.8) (56) Juko Joneda, Scott Grahom, Frank Е, Ganned, Cloning of à foreign Gens Coding for Alpha-amylase in

Bacillus subtilus. — Biochem. and

Biophys Res. Communic, 1979, 91, )i 4, с. 1556-1564. (51) 4 С 12 N 15/00//С 12 R !/07, i/085, 1/ii !/22 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, СОДЕРЖАШЕЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ АМИЛАЗУ, включающий гидролитическое расщепление ДНК бактерии— донора, последующее соединение полученных фрагментов ДНК с вектором, отличающийся тем, что, в качестве бактерии донора используют бактерии Bacillus megaterium

СЕВ ))- 11568, или Bacillus coagulaus

CIB Ф 11571, или Bacillus cereus

АТСС 11 - 31102, или Klebsiclla pucumoniol ATCC В 15050, а в качестве вектора используют фаг g NM 590 или

> NM ?81 или 3-NN 989, или плазмиду рВР 322, или плазмиду рАСУС 184,. или плазмиду рС 194. (,". 1I - 1(ЯЯ рс КЦ (Я:

1= !! Я

Р.) 1! l l .",1. I)>l!(: (!.;:;.; ная (е::T H ая

ПОТРР 0 !)IЕ Т .i!2 = .H"! 0!!

iRTO. i ., с! Г

Обретение О,—.носи-(1,- бпо х-Поло гии, а именно к про(и заодст=.ó река?(бинант?!1>(х !" (Ш . ):;:.::;:, р;ка(((их г:- и, кодиру!()щии амилазу.

Г P И М Е Г) I., Cil(l!IH!!, HH,!H . 1 а. IГ>с!13 с>! (! JIB.>) ((11Я вЂ”..(IOHHPOВЯНИЯ - ЕНЯ П)РИ?,(Е?!1!(с) Г

С,.!ЕД!)«1()1)(ИЕ MP Т PHñiHÜ. - 0= 03«!11-!ИБЯ 0))(сан знпон;"клеязя и!.-.пa .!1; „ ;HK !!Игаз-я

;-кс i 3(c„-дие«! (b.- с(-,T(г, (1(ЕН )1;.,О(Иа(- . (()а а !, 1;! с,)с(«(;1:1 Рс)

ЦЦК ?(n T()рой пол))чена и -. кле1.0к К с-;— !. 1 Обпаоо та IHb «.". J tH . Оц?г!(с): . -1- Г 0 л г ие !.—! E плотности х тор;:-(да цезил - брг ми,(.-::

3 ТИДНЯ ; ЗИКР(1(! PÃ33",.(ЗМ; .:; и )Н. !, . (ТЕриH! бс.! 1 l>,t Tl(t ==! . ЕГ1?IT(i I . 01 Е,,)! (1. (((ими ?!орГроло>гине скиг!"!и г.ризнак.- -(и: ,, О С««! Cbt), !!0) (СЗИ?КНС(,, c:1 0pb! ТFpMI- .!-;а:11

?!(,(е и -. убте р! (?(?!Ял!.нз(е, :

;к?(д(ся)(п.сгтате ti>Hая .;.)е а . p0(KO lP О К(ИИ,.

I 00. (F p3 Lit! !!!(3 (с т(>13 = Окр) t

)11«. (ОКО: ПЕП ТОНИ З;IР " C i . > З ИЗ 1()НЕ— ,)«

:-iИЯ p! i >

>ОС С ТЯ: ОНT :с.н. Е .Iи 1 1:а" ОЗ = о !б р а ", о = си 11 - 0 2 р 0 н о, э », ЕЛ1> (Ic! ?I )!

1(03 Ь И(!О i ) - л 11!!О 3 \) ГЯГ ЯК T(>З,! ЛЛ ()3?C3()0 Зу )! С,)ах(.QJ! И 1!, * . )О ":=., .0.1)

ЕННс(Е И=I H?(X ..=; (К!)Г).-;у;-".а -".;; -., Пел?-,био:; ., «;)Iу.ти: и -.:;-! з !?: .

ПО ТРЕ: ?)1 Е: 1(!« .. Г .=. ГО! !!:.

«(ОТ02 0ЛЯ = 1 !!О 00И "03 И, Я)Н:->1=" : !

", ин,. о . P :";,,Я . е.(I з н с Я, ;; Е O.Г! ?1 3 . С,Г13 i) (>. Й,.;

"(ЕТ IЛ TI 8 . 0 С Е". )- Е)> ° ЗГ t >НН(c(JO «+ . ° v 1 .,!(, !

?.,! . ...:I 1И I l !,: I! IH !)% с

> .! Ic Cl t ЕГ. )10),": .-! i )П

« !

)tl .. ! .;-. 11! .)С-,Г.—.-,:-,! 1;.,-1!! ! !

1 !1 Р ;; >Г 21(И. l н «. =..: ., . i Р

1;, Ê lя;->(;,1-;.: ) 9(:! 1,, 1, .1-, ; 1-1; !» —,." 1 )!"-. CJC );,; Е.-. ,. С !!«1" с p !! . Г!. Г 11. .: П 00;! С 10,;HI 1, \ 3! .- - »: .1(1. I !80 двух комплс ме!iт;|рно;|ефектив||||: лизатc)ki фа| | (лямбдя Пяш и ля |б:|я

Eam) индуцировянных из не (|оля||:|||ющих п|тампс|в . В "(Ой сме(|и .,|юбaki молекула ДНК, имеюп|яя края cos, !!!К лямбпа и соответству|(шие рязмерьi, может быть введен(! в протеи|! фягя, таким образом воссоздавая in 1Сго биологически активную частицу фягя, способную инфипировать E. со 11 и продуцировать центр инфекции (пят— но) .

Чтобы оценить эффективность этого способа, были выполнсны двя контроль ных опыта.

Образец смеси был посеян на

E. coli, было найдено Зх10 пятсн ня

1 мкг введенной ДНК лямбдя. Это приблизительно в !00 ряз болыпе, -е | найдено в расщепленном препарате, и указывает на болыпую эффективногть обработки лигязой.

Полученные таким образом пятна были исследованы визуально. Из них 70 -. были прозрачные, а не мутные, что указывает «ià присутствие фрагмента

ДНК Bacillus megaterium, который стыкует и, следовательно, иняктивирует лямбда ген С1., отвечающий за помутнение пятна.

Таким образом, можно оценить, ч го препарат содержа | случайно выбранный образец всех возможных фрагментов

Bacillus megaterium Hind Ш ДНК, совместимых с введением в фаг лямбда

NN 590.

Отделение деривата фага лямбдя, несущего амилязу Bacillus megateri—

um.

Остаток инкяпсидированной смеси был применен для заражения Е. со(1 на болыпом количестве крахмалсодер— жащих посевов приблизительно 10 жизнеспособнь:х чястиц на посев. После роста заряженных Е. coli и образо. вания пятен посевы были отсортированы на присутгтв||(пятен разложения крахмала. Э1с было сделано путем кратковременного действия на посевы парами иода; предполагали, что пятно, образованное аким фагом, будет окружено прозрачной зоной, образующейся в резул| тяте диффузии и действия ямилязы из лизовянных клеток.

Одно такое пятно,",ыло найдено и фаг, содержащий это пятно, немедленно был отс б| ря ||;|-, я с убкультивирова— ния (длится,ное действие паров иода убило бы фя. ) . !!отомство этого пятна!

,". з "|||(1 :",| |. I(1с ь В ч | с т(1 т((i! P(!! у!|и!|у я

;|ми:|азу) и обозначено "ля||(ч|(! NN 590

Ап1у 1". Фаг лямбдa V. 1 590 Amy I сдан на хранение B Национальную коллекцию промпппленных бактерий 12 февраля

1980 г., k-ak(NCIB II 11569.

Повторное клонирование гена амилазы в плязмиду рВВ. 322.

Это было сделано с целью штамма

|0 свс рхпродуцента, а также с целью получения большого количества ДНК с геном ямилазы.

1 мкг ПНК из лямбда ИМ 590 Ашу 1 и 0,3 мкг плазмиды pBR 322 расщепили, смешали и обработали лигазой, кяк описано вьш|е. Этот препарат приме||или для трансформации (по обычной методике) штамма НВ 101. Отбор производили по сопротивляемости ампицил20 л;|ну (яр) — свойству, которое сообп|яетс я клеткам в присутствии этой и-!язмидь . Обычно эта плазмида сообшяст также сопротивляемость к тетрациклину (Тс). Однако введение посторо íåé ДНК в эту плазмиду расшеплястся tet ген, таким образом содержание чувствительных к тетрациклину трансформированных клонов отражает содержание содержащих плаэмиды клонированных ДНК. В данном случае 16 клонов содержали новую плазмиду, которая придавала амилаэе активность к E. со!1 (в соответствии с современной международной номенклатурой плазмид новые плаэмиды, описываемые

35 в изобретении, называются (рСР), а конкретная плазмида согласно настояшему примеру обозначена (pCP 1).

Это показывает, что повторное кло нирование гена тем же самым фермен40 том (в данном случае Н пс! Ш) является очень эффективным способом (16% вместо 1:10 ).

Штамм, содержащий плазмиду, обозначен Е. со Гт CL 7001 (pCP 1) и сдан

45 на хранение в Национальную коллекцию промьппленных бактерий (ИС1В)

12 февраля 1980 г. как NCIB !! 11570.

Амплификация и продуцирование фермента.

Продуцирование фермента в содержащих плазмиду (pCP 1) клетках улучшено двумя способами.

Насьпценные культуры.

Культуры инкубированы в течение о ночи при 37 С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрленмейера, содержащих 1 л культуральной

1. 1

Г))F I(sf (1,В; прожжевой -)кстрякт

TPHI1ТОЕ1) .

Хтторямфеникольная я (плифика(и(я, Культурщ инкубировань. при 3 7 > С ня вращающемся вибряторе в пятилитровых ко.пбях Зрлее(мейеря, содержащих тт культуряльной среды (1 ), до достижения плотности 0,8 (650 нм)., после чего добагили 150 мкг/мп «лорамфеникола. Это предотвратило дальнейшую репликацию хромосомной ЧПК„. но не репликацию содержашей ген амиллзы плазмидь> (рСР 1). После амплификации (до 3000 копий) плязмиды ис) сравнению с хромосомной П)1К хлорямфеникол был удален. чтобы мог продолжаться синтез протеина. После амплификации клетки были Отделены от среды методом 1!ентрифугиро(3яттия, промь:ты для удаления хлорямфенико— ла и повторно культивировань. для продуцировяния амилазы.

Выделение фермента.

>пля выделения альфа-амилязы в

Очень чистой форме применя(BH, метод

"осмотического и!Ока". Способ, Огплсянньи" Х. С. Пей и П, A. Хегпель в .1. Втой. Chem 240 3685-3692 (1965;! заключается г, следующем.

Сначала клетк>и культивировали в течение ночл,, после чего их сус!Еендировали в 257,-нем )Bc"-воре сахар >.3ы в 0,5 Гбьемя ку:тьтурь. !и ттодвергли вибрации в течен * 10 мин при 7

24 С, в результате такой обрабо m(и троизо!пел IIJIB lì".JIHз клеток . Зятем добавили З,ПА к ) мм конечного >яс..— вора (чтобь(стенки клеток стали иронипяемыми) и материал подвергли вибрации в течение )О мин при 2-, С.

Суспензию центрифугировали и клеTI(1! быстро повторно суспевдировал:. R холодной (-„-риблизительно 0 (") I)оц.— и псдвергпи вибрации >",ðè Отой ж температуре еще 10 мив. Суспензлю снОВЯ цeн т риф "т и роз яJIи и из в с и. 131Т. шегс слоя и(:;кно было выделить 9 >" фермента.

Лпя сравнет(ия:сультивирсвяли. роорганизм — донор (ВасiIhis .и

tedium и .)I рецелили фермен,;-,ТН >и- к. у активность, Количес тl G ферме; тл !IB

) мл культуряльной среды опт)ег(е.;11.".: по метс:,.-.,у 1))С );(риче:: Одну фермеl!" ную единицу Определяли как коли ество фермента, проду((ирующее 1 мг

130 c I. тано е(. Te(IHn J О Г я«яра (с Г!рим>. и( нием мя ть по lfl !3 (;лчестг -зталонл

ll fI: I (> I3 f1»1! H)i, Е> 1>3 l "; ; с . и > е

: ии и(и; (б>лимонно.:> в, с 1((и, С,;.()—

>л б(тп Iiu(11 1 чиГTn:-> я(Р ° Ой")!перо, р. уциро— .) ° ((, вял 6(5 () ф»р>,!еп Е.не-,ех ед, I у-ьтypbI.

>)и: ыщ ":!(!i((ку) iтуры F.. сс-. (i С1 70Ñ1 (т)01 I П))О)(у и -;»О в я и 1 1 6;- е >-.

К)1 IЬ I i>т)Ы. "ОГ)ЕЯ КЯ)С ПО C ÃIЕ К F! I (ИВИ

">(:3 ян я (ямl .. >> фикя и ни) 13 -. -:i>(e ие

> (. «порлмф = -1-!ко:том с пос.>едуюпим

"" . и: . . 313 и>3О тян("-м в течение ) 5 —. бе-. хпортт(лфен(исо тя бактерии F.. с Г > .т СI.

) ОЛ! (рС).- ) прс)дуцигсвя-! =; 84, =. ед. /л .ITI) >токязыпя!ет, и;Г ме-;njl вс(сыпIен-! нь х;с> льту ) обе Гпечивя е т ЦО с .. я точное

> ":з ппе IHe . .I;О,,упирова!Пия феп((ен-.л. фе рмент ттр.-.дуцировяепи и Г.лктерияF., со II-. ".;ь 700 :: (pCP 1) .и.-.;ентифи— ци .-.Овянный 1(BK яльфя — ями:та за, имее "

> с !i.: дуюп(ие свой-. тва . Он рлсщепл яет

>(мипазу и ямилопект и HB глюкозу, ь!я(ты . ту и !(B! I ь то трио 3 у, .Гтя ным (, i", ) я. лом мяль "по 3у > и ря сшеппяе т цикло

„Ip :

-":-тл(-тоз-. Кроме того,, фермeит ряГ.— (и» >пя =. и п».т тула!> Иа пянозу И7 или

) !та; —,cз

8(лт ;!I(Л() i .р Е > О>тожЕНИЕ ЧТО МИК

1>Г ))) - -FH BM Вя с i ) . е .1. - п1е я я t(е) т т!еп явля—

Р---я ВЯГ I "епв c i ГГП):Bius .

). и м с-. ): 2 . >.(О >ивова-31!e тер

):-. <(:.ГО I 1-1 q B.-п,фа — Л((Е>ЛЯ g „, Уи к»ОО» я:!измом ДОнором бы) исход

--ый ш -л(ь! " яс ) ет)uя 3ыпeJ!eI нь>й из

-!пос гл li ". д»нтифицированный как

В)л . ." . "(Is (.Ояgulaus,. Он ироду:",!р:ет

;.-; l тГГйк ую я.гьфя-амил:-.=-.>i и отпичя; -, -я; fe>, > .>)1!(HF>(1. l",их роби оло — ич е .1(им(:".»Из,н -сами.

-п)р(1,спо-)яя: палочки, О,";.— )«2,5-!.1 к,:), (Одв ижеть!е г р ямпОлГ я

:: I: (-:ы v. pамс Tp! öà-.ельные. »пор(, .I О .. = I .F.I .- . и:Iи терминяль !b!e -. i(с ;, ) 3 i i О и >т н 1(в(я, ) и чт"" е:f,! ый бу:тьон;.;:»;)()и и рос т,, Е:!, Iilil;.! - К С;Illfeиf:,)И, (Г:: Р:;:;;)(il. .и(r — - (- !" ые

-1:Исй ИОЛ / (IТ ЛI.I(;!Я ).. С>1. j(И)(n is I,") T P11I11I с å -l I,,.- :, . ; ",.(: is О 1(И". ;>(ф»fl .I. I Я). ;:. :" > >1

l23! каталазная реакция: положи гг.»ь:» ls» q прадуцирование индола: o p ua;e»»,— ная; декарбоксилазная реакция на .(изин: отрииательная орнитин: отрч5 цательная; аргинин: отрицатег(ьная, образование сероводорода: отрицатель»as;," потребление углеводов: ",.атребляетЗ пуллулан потребляет на минимаг(ьнои среце; пстргбление многаатомнь»х c((upTOB потребляет глицерин, сорбитол, маннитол, инозитол; не потребляет аданитол, дульцитол: уреолиз: отрицательная; потребление лецитина: отрицательная.; оптимальнas: температура раста а

50 С; максимальная температура расо та 55 — бО С, минимальная темгература роста 15-25 С; о потребность в кислороде: аэробный и анаэробный.

Штамм сдан на хранение в ИС1В

12 февраля 1980 г., как WC! ¹ 1157)

ДНК экcòðaãs(poâàëè и подвергали действик» Е. "n R I; Hind Ш; Rst I;

Sa1 T; 8am HT и Bgl,II. Только Bgl П мог произнес.ти ьинагс фрагментов в широком диапазоне молекулярных весов, Оцнакс можно было получить фрагменты с Fco R I и при концеп,— рации хларида натрия менее 50 мМ, Поэтому решили применять Есо R I для получения фрагментов для клонирования в Есо R I переносчика лямбда

ДНК (лямбда ИМ 781) .

Расщепление ДНК bacillus coaguХасs и ДНК лямбда NM 781.

1,25 мкг ДНК лямбда ИМ 78! разрезали одной единицей Есо Р Т в 25 мкл слецующего буферного раствора: !О мМ туис -HCP (pH 7,5), 10 мМ 2-серкаптоэтанола. 10 мМ с.ульфата «магния и

100 мМ хлсрида натрия. 2 мкг ДНК

В. coagulaus разрезали тем же ферментом в аналсгичном буферном растворе за тем исключением, что концентрацию хларица натрия понизили до 50 мМ,,Инкубация продолжалась 2 ч пр»л о

37 С и реакция была астановгена о нагреванием ри 75 С в течение 1". мин.

Полноту расщепления контролировали методсм электрсфсгеэа в !%-ньх ага20

Зс

Ci . 8

Расшегле»»»»ую ДНK сме(;.(»г»а.и» и свя —»и с \ (p(»мe»»е «» t»e»« гs тх ел(а|" (Тj( !!!К г»игазь» d ага Т- (в смеси. содержа- щей F,O мМ тр - —. !С Р (pH 8), 10 мМ сульф»та маг(и-.я, !О мМ 2 †меркаптоэта»-а-.а и О, 1 мМ АТФ. Ргак»г(лю прапсггжа и 10 — 15 ч при 1О С. Псс.":е связывания аликвотные части О, 2 мкг

ДНК смешали с ЛТф цля палуче»»ия ко—

-z неч»(сй концентрации 10 М. Эти аг»икnoòHü e »асти подвергли инкапсидаиии у1 гго (» г(р»лменили для инф»лцирова-!

»я шт .лма НВ 10! Е . co I i . Бь(по

-„oп чгнс сьсло 1,бх»0 I!0F. (пятна

: бра зую(»((»х ец(»ниг) на 1 мкг nsìá",,.1НК, Нексторь г иэ этих фагов проявил(л аь(илаз»лу(»(активность (обнаружение аьн»лазнай актиz »oñ cè на чаьпсах Петри вьцгелениг и очистка фага аналогична примеру 1).

Наблюдалось дагольна большое соде-р..»ание пponyu»p-.òãëÿ амилаэу фагов (1 в - .00). Один был отобран., абозна-сн "ля(ба ИМ 81 альфа Аг(» 1" »= сд;,и »;а хранеии г NC!В 12 февраля

198О (., . ь!С(В !157?

Поьторное кланчгаван; е гги; а«(ила— я (бчe «! 78! г пьфа А-1у г-,; " .(-,! -;» ъ pHR мкг ДНК пя." -бда !1М 781 ..ë-;üôa А»г»у 1 т-. cne же кс-»(»=.ec гвс ЦНК плaa (иды

-рВ»». 322 paspe san(Есс к Т пр»л абьгчнь»х .;-..-.св:лях, Свя=,ывание и трансформацию выг олн.ллг, и= метод:лке описанной в прим.ре . Kono .чи Е, cori, содержащ-; рексмбинан ";-:""ю плазмиду, обнаружг:ы по амилазной активности. Одна такая копания отобрана и сбсэначена

F., col i Сг, 7002 (рСР 2) и сдана на хранение в КС1В 1? февраля 1980 г. пад номером МС. В 11573.

Амплифчкаиия гена.

Лмп.—.ификаиия кодирующего ами(»азу гена лямбда !!М 7":! альфа Л»((г 1 и процу, (;рова»и:e амилаэы осу»цествлены

c(e,г ш«м б» «;

Бактерия — хазяи»-: (E, саХ» НВ 101) ку.-,ьт(лвирсзана в (.H среде с 2 мМ о хло рида м:-. ã(-. (» s пр(-. 3 С до до с тижен;-:я оптической плотности 0,3 (650 нм), За.тем добавили фа- лямбда NM 78! а ьфа .и(: 1 ка ичества Фагов было рассчитано так, чтсбы множествен— нс сть заpажения составляла прибл(»з»(-.ельне (-2, т. е . один или два фага на одну бактериальную клетку. 3атем разных r eëя::.

Связывание и выделение рекомбинантных фагов. продслжалн культивированиe =,нерг-;-."íoì перемешивании при 37 С до понижения оптической плотности, Когда сптическая плотность понизилась к«гжв

С, ?, культуру собрали и положили

1:.Я лед. Культуру центрифугирoaaëè и

ВСПЛЫВШИЙ Ст?ОЙ ИСПЫТЯЛИ На ЯМИЛЯ=)

«ую активность.

Амплификация и продуцирование фермента Е. co(i CL 7002 (рСР 2) ссуществлены по методам насыщенной культуры и амплификации хлорамфениколом, как описано в примере

Амилазную активность определяли па методу ДНС и в лизате фага и в культурах Е.. со11, содержащих рено.:)в бинантные плазмиды.

Б табл. п, ре,дставлены значения,, палученнь)е для амилазной активности в исходном штямме 3. соаяц))ацв „ и распределение между внеклетачной и клеточной активностью.

Приведены также активности, :олученные с рекомбинантным фагам (лямбда NM 781 альфа Amy 1) и щтамм, содержащий рекомбинантную плазмиду

1.. c0li CL 7002 (pCP 2), Достигнутс примерно трехкратное увеличение 1-.:рс У)Ц11РОВЯН1тЯ фЕРМЕНТЯ С ПГ)11МВ 1-; ВН ЕМ рЕКОМбИНаНтНОГО фЯГ-", т.: Ещв бОЛЬШЕЕ увеличение наблюдалось с плязмицзй (приблизи-:.-Льна в 300 paç).

В СЛУЧЯЕ 1тРИМЕНЕНИЯ фЯГ;- Лям5г

ММ 781 альфа Ащу 1, вест фермект выделяется вследст===)е и= .èñ- K .еток и, следсвательнс, находится в куль-туральной среде Ь =лу:ае -:..pèìeâяни;. плазмиды больщая .-1асть фермента (967.),«)я)ходится в клетке.

Повторное клонирование в дерив-?т фага лямбда, способный к .лизису

Е. cori.

Для иллюстрации тгриготовлен я системы переносчик — хозяин„ со,цержящей лямбдя лизсгенный Е. с т.ь,, проведен следующий эксперимент:

Бp JY.=HeH бЯK»герио т)«)г г)я1 !с/а Т :

7J.g CL 857 КЯ Еащ Бап) (лямбдаХМ 989).

Эта:: фяг содержит ген ДНК лига-:,.=;, бактериофага Тт) и спс.:i бен к лизис- .

Е. со1?. Крот е того, он сод)ержгт термочувствительный ген иммуните.я и две амбермутации в гене Е re-ie

$ coo 1?eTcTJ?eHHO, МУТЯЦИЯ дает бактерии л)?зираваться под д-..jiствием инфекции этим фагом. Делью субклонирования было заменить ген

ДНК лигазы геном, кодирующим ямила:::

ДНК фага и плазмиды (рГР 2) бь)ли расщеплены Еса 1«Т. и фрагменты бьл:н связаны. ДНК фага, полученная в pеe1233803

ЗУ.".Ь ТЯТ--. Л) Г ? 111.1 ..:, . ) . i Я Т,"» » ",jtajri —

ВЯ!-Ы В« ? Чс? ТЛ»110 ?У ЕМ! iii;001)r? ":" 1ПТ»АМ

ЗЫс=. ЯВ11ц Р Яj".. 1»=I -1)тю ЯК ТИ В1 .ОС? Ь ., б)>Г? И

00! раны я 11»- --,иве;-: по сгисял) 0;! . )е ТОД»1К Е, Зяте."1 "-. i o:-;1)»1 бал )? риме:eH; ля ,-:--«1 .Ировани;- щт» )мя л ., со Iã..; ?00!

) ?.).-!, I Г С От,".Ь)тт«ОЙ МВ РЛИКЕ .. r!j;a 0—

ГВНHblr» 10;?01»)1И 1)ЫЛ" Г1! i!?Я1?ВЛЬ) BVa)J:=.льHc в» кт?я- )я, Icciдержяще1" : э це с л13«п)в i т не?- I" e I Ода .)Кра)?1и1? Я ни я ЙО I0.4 . .- Я Хра«ie"-т.иВ;-" 11!. 3 1? Ма:r"т. a . 980 Г, 1i0! в.)M »j?01: c = " 1586, А)и11лнфи . я;1И tr eH я r ття)Г С В ттв i»я ,,).: т)У11)Щт1»т1 - F»! !:;,-.11 !

» ., Л1)-) )-"- эт-1Л ь)рящЕН;р1 32

r )= де Е1»,-;1лс) I"Hi r- т)? 0 8 jr p)? «)т) з-ятем ej.o . =H-:.,ð-":. „1)вугировялj: и «J!е —:-;:-.

?тспе-jrrH13011 а Jjè 3 ".- важой среде LB ) —.рецвяритегьнс )ягретой до - ) ? )C. Г:о— та .: к-. Ль-)»тру и«гк»уб!«1вов ял; .:; во„"аной т; .- Я-тв Г1-:)И Ч. », В ? e-ЧHH!»ie .,-1-1 С;;Е—

;-ii И«1дтуц).=ГОВЯ)I "r.-,! Л1. Т« —;:1:»СК )1 0 ",)-,1; -Я

Г = Н «1«В )У Н т, т Е т В -r H -т Я Е Г С и в:; 0-1-;вс т::: Hтт=л =:Hü.—:..:1 :, ЗН: — ". "I -.НОМ 11Еpв.»)e;)Ч), ЯН И! .. :: И» т

Я --л" »:т-: 1В Ч -1 Сrj.» Р г 0, тт»»-тст1 rijH

JI. - ir УЮ . КТИГ il10 . Л1 E . i «»1ВЩЕ).

1- . "т. .,т.—

: г.

) "т) " 1?К Г(вpriirre i "1 «1ЛЛЮС Трнрув .

)! . 1 0 г Г.тб " С .т т„!-10 т1?рсавл1 г ИЗ

:.",»Ямидь) ";:. новый гямбда фаг. ДНК .-)з .—,. «тбГ-.. I . Р! "81 Я.тьфа, Ату 1 може-. . м;!» т= .к ж» Jlej О .. у Ок.10нирОвяня j? ф; . J;1.11бд Т - ) 11) 8 С! 857 )тт»п? ."-.а;-Я, .:;:;:и,:;;е- доно рн я дН)К мо,;,.; б.-т«-, ье -Iei-„..: р,1,С-ТВЕНН;; = -;КЯ-!

1 1 "ИЯ.!1 "0); 0 ":,СЯ"-; ! т?

: 21380"-:

-:,абрл !973 г нод номером ЕЕВМ-Р ((т 239(, а также в Американскую кол.лекцию культур под номером ATCC ((3!102 2б декабря 197 г. Р(звестнс,. что он продуцирует как бета-амилязу, так и альфа-1,б — глккозидязу.

Клонирование геня бета.-амилазы в ллмсда ММ 781.

Пр}тн(ята такая же методика ограни— чения) связывания и выделения, как в примере 2, ДНК 2 мкг) В. сегенв была Ограничена при обычных услозилх ограничения ферментом Есо К 1)

ДНК переносчика фага (,1,25 лямбда (((М 781) была разрезана тоже Есо К I.

Связывание и упаковка были осушествлень, кяк описано вь((((е.

Выли обнару)кень". несколько реком— бинантных фагoB . Лрс>являющих амилазную активно(ть (прибт-:изительно .т>00) . Был отобран оди}(из зтих фягсв.

,обозначенный "лямбда ММ 781 бета }}})у 1") и сдан на хранение в ИС!В

2 февраля 1980 г, под номером ()(С1В : 57 тт

Повторное клОнироБЯние генЯ б(Ta " амилазы из лямбда ИМ 781 бета А1()у н плазмиду рВР. 322.

С целью 1(свыпен((л проду }кровенил фермента этот гервый клон бета-амила." зы был применен B качестве источникa кодкрующей бета-амилазу ДН!, для субклонированил ее в мультикопию плазмкды рМ 322.

2 мкг Д«IК лямбда Ы(т(781 бета

/((((у 1 и 1 мкг рВГ 27 были разрезаны

Еco » I ci«(pEBHH(и Обраоотаны 1(} газой. Связывание и трансфор((аци1( осуществлены,, как oIIHOaíñ выше.

Одна колония на 200 устойчивых

}(Я(»)ПИЬтИЛЛИНУ КОЛОНИЙ ПОХЯЗЯЛЯ ЯК тивность к разложению крахмала. Qpy-гая выделена и обозначена Е, СО 1

СЕ 7004 (pCF 3) и сдана на хранение

15 се»-.}i5pa 1980 г. Лоц номе "ом (((С(Б ((! 1 6 0 2 .

Повть>рисе кло.(ирован е:-:- H"= бета— амилазы в дериват (()яга ллмбда« с;,сссбный к лизису Е. сс(- ..

В качеoòçå перенссч-лка бь } приме}- ен те ртмсчувс твит ельный лямб)да

3 i g фа(- C 1 85 7 l Ó Tn Tt am .. т.., )(Л.«(б

1)М 989), of ис.анный в примере 2, 0 оло l мкг ДНК Глазмидь! рСР 3 (1 О, 5 it(кг

ДНК фага были расщеплены, затем фраг. менты связаны вместе и полученные части Д(IК упакованы >г(>.(1 0« Частицы фага„ . ролнляющие амилазн >T;) aктивность„ )ыли выделены и применены длл

-НИЛ t)H 01 . Н}!Ь.Х fO.)O}tl ; .;(, (.и—

«

1 п»«л т,т «- тт— я т(3««(у вт,(т(е,е го (т-;, j(., a«„,»(1- ,,1. л т с енныи д.(л .:. (. с нолт--. :) (ñ фяг". .был вы™-е.г ен

--лб-;л 980 — . -0«) vo!v ÐÃÎß !С

1 01)3 « т) - «

Г ); 1 т-П В С(т)1ття at«(H "(С Зт,т

Вbll}a о с "1 (ес Гн Iеня, пс и" иса:-}(0«(1Я iы в ра }л}1-}ных к:(снах.

". Ябл. HI)едс (Явл }(rrpомен-,,-,— т) Гитlтa(а Л ЯК т BHC)((т т(. Ходит т", (я та») . П-. (P=IВHЕН(»Ю С -IКТИВНOСТЬЮ В -Тт:«.— Х

:(i:снах . .1т . активно сть Определена 1ибс:-(о ли=ату). либо пс. методу ссмотического

; -,аоа „О}(К СЯН- т и т = и >ИМЕPP

1f Л, и i(В ), т«Г -Снт}роВЯНИЕ ГЕНЯ пуллан азы. ! (Ик втоор гани змсм ПОнОрс1»(бь(л KIeb

Я!Е(>7Я Pr (00((1}СПт (! » СДЯННЬГй ««та ХГ>ЯНЕ—

)(>(е- в (t) 1" C (с («ю((я(9p т т) t) r} i or««p

; о;: "" - : 5С(50, 2, 7 .. МКГ Г(НК дОНСра ЭКС-:оа:.-1;0ОВЯНЫ

:")DaT (;(ЕНТИРОВЯ(:.„: :Е00 R Л Г)блгт}Н}тГЛ .)«) }t:"Х H 1,. 2 5 -МКт gI«I(«i(,ô (;=. М>«! 78 I рь.: â€,,езаны этим;(е ферментом в т ;:-(х

}-.

Х(Е уСЛОВИЛХ . Ин Куб а(тИ4 H!»C.;,. СЛ:a Г(- Г-., при 37 С, .-,:Осле чего:-.,paò(-цкю

«НСВИЛт,-, П»т 1 ЕМ Haf РЕ«}«т =. (Е ЕН«те

„о (,)) МИН Г(pH -. С, НОЛНО-.)т ОГрани -"ЕНИЛ

n ; )c пет(л (Tr«t т а»(. «Я«(oi Igl a}-:0 B Ttpyiл,Q ь(т-.. Li =- 2

Г ран.-. :.=я(-*ЫЕ Дг (СЫЛИ:ВЛЗ НЫ. т —:,.;.:-л=-нь:. (рименены длл инд)екци«( мер> 2 . 1 О !,--:.::.-:; Ок-:.-тс 2х l С Н0Е

» — т "0 t t)jT т т, б(.

Г

ii а -(еl!i .), Г е. )к, . ofi -,.;p(}(.(»(В=,!

"т (." . тз(Е:. Л ., t .. " а «riTH Птт i:.. у (а } Г-Э

«ту»Г(, Ь,--, .- т(; — т т цяМ-:, арак .«

t .I);(r OH б)i(;rO (Эт)>т, ;-. . !,, СС ди((бЬ«((СТ(:(:i>r".. К С .. Э::ЯЧЕ:-.

})и ) —,, И(()И (а! Т, Л ) «т На Л Мттi t P ", т, !

0 Бо всех клонах к (" бк«-о}-ах амкла-.Ь(>т)() а!»ТИВНО(:T «i Î Ipp тЕ}1ялтя»ПС ((Е.. Г)Л»: еp)»f(==Ha;(роматограммами ВСК (}1)((С"r; Ствнт) ЕЛИНИЧНО> О Пятя: =;ал>-.-С

l 2338(! 5

Т а б л и ц а !

Всплыв1

Увеличение проПериплазКлетки

Культура ший слой дуцирования ферменма та

В. coagulaus

Лямбда NM 781 альфа

Amy 1

3,43

144

E. co1i CL 7002 (рСН 2) с Cm амплификация

141,2

5700

230

Е. cn7i (pCH 2) ванне я

СЕ 7002 культивиротечение ночи

320,6

276,2 12960 232

Е, coli CL 7003 (лямбда альфа Amy 1) 26,) 1162

Одна единица определена как количество фермента, дающее 1 мл

О эквивалента мальтозы на 1 мл мин при 50 С с применением в качестве субстрата 0,57. амилозы.

%Х

Метод осмотического шока не был применен, но был осуществлен

11 лиэис, так что это значение представляет сумму амилазной активности в периплазме и клетках. хранение в ))С)В 9 апреля 1980 г. под номером NCIB Ф 11593.

Пуллуланазную активность определяли по методу ДНС, и продукт гидролиза пуллулана лизатами фага идентифицировали как мальтотр озу методом тонкослойной хроматографии.

Лямбда NM 78) Pul I содержит большой фрагмент ДНК (из KlebsieIIa

pneumonike) 13,5 килобаз; этот фрагмент был снова расщеплен Eco R I Ha два фрагмента 6,1 и 7,4 килобаз. Затем субфрагмент 6,1 килобаз был повторно клонирован в лямбда NM 781 и установлено, что он содержит ген пуллуланазы. Этот новый рекомбинантный фаг назван лямбда NM 78) Pul 2 и сдан на хранение 15 сентября 1980 г. под номером NCIB Р 11604.

Субсерия 6,1 килобаз была затем еще клонирована в мультикопию плазмиды рАСУС 184.(дериват pBR 322 с г К

Т, геном последнего и С геном с одним участком Eco R I). Этот новый клон назван F.. соИ CL 7006 (PCP 4 ) и сдан на хранение 15 сентября

1980 г. под номером ИС)В 1!605, Третий субклон создан путем введения фрагмента 6,1 килобаз в фаг лямбда ММ 989 согласно примеру 2.

Этот клон назван Е. co!a CI 7007 ( (лямбда Pu f 2) и сдан на хранение

15 сентября 1980 г. под номером

NCIB N - 11606.

Уровень экспрессии и амплификации пуллуланазы был изучен у всех клонов.

В табл. 3 дана экспрессия пуллунаназы Klebsiella в клонах E. cori (активность выражена в единицах мальтозы, эквивалентных 1 л культуры) .

Как можно видеть из результатов, пуллуланазная активность индуцируется мальтозой путем добавления 0,047 мальтозы в срезу, Кроме того, для выделения пуллуланазы необходима обработка Тг1г.оп х 100 мембранной фракции, и это указывает на то, что активность локализована в мембранах.

Иб(гзя ак—

K".ЦE T" Р(г

ТИВГГ(:С I Ь, ед / г:) В а с i г 1. и з Г е 1- p (I s

Лтсс 31102"

fI;.- Опр еде;(н.:а(ь

1420

142;;

Г1ямбда N1(1 781 б е та Агг(у

Г. Co 7i CL 7004 (E2CP 3 ) со /;а/ ° -- 7

17. (2?,8; 76,4

19((4,,2; г. гф

М

Клеточная актиВность: ток кх г

Культура выдержана в течение нсчи пр 30, (дрожжевой зкстракт, !%; бактотриптсн I,; аз(ори, I(a г- ия 0, 57) .

Х (М

Культуры выдержаны В

CO C TBR P КУ ПЬ т гР(1ГГЬГ(ОГ ( Iqä/II-l

"*.ММ М

Культивирование гтри 3

В ВС ЛКГВШЕМ СЛОЕ И В К(в-,r;,Ë":Ê лямбда Агп;;z гг риме р" 2, Т а б л и и а! г P м б р а H h . I У в е. л H ч P н H (!

КульTypÿ

13Гпл iE!i .Iий г « ой продуггирс/-ванин фермента

Кгpбя1B гга малт тоза

11М 7Й! Ргг У 1

0 7rYiN 781 Рп)7. I+ ма гьтоза (9, Ь/

NM 781 Р, 23, 8 (9

1!! (781 РИЗ . .+

8, (3

26, /

78 г Съ

Г о 1/ I 01. 7006

1, г !! / ) д г

1г/- ((г; р( ге(я(1(Е. Poli CL !005

,лямбда бета

Агп "г 1 ) В:гекле1с;чна» J К.гpòî ная ( актиВноГ I ь - л? Гив IIГ) Г TI г ог, P.Ä . II l /,)

Л обр бгГ -к.i ллзог(имом с .—,изисом гсле— с,.

—,е -/ение Ho„- пр:--; 7 I и:; таком:с(е

-«37 Г,, (ктивность опредс-.гя/:и после лизиса, как для Е, со11

1 тл д

Kv !! г :ря:., нну,ерк;!н. ь„ : - е :е;:; е ночи. к

Ку-и,.-инигондн )е- т;ри кнеткн;.; тто; е нияион, и 3>:еря. ;и н. неГ янп кл" ar :я:!ÿìáò12 лн;..ол ос н -- -: 3е и

Корректор !. Мнксимишинец

" .е икте! . 1, "1о.i!K они

3 сяк я.-

I H,!» :: "". Р ио ге tä и ог,;,p, : и и о! ко

3, 5, "1Оскня Ж вЂ” 1 3, 1 Г, ;л к "я ..с .И -, л, 11от-ииоиоp (роиянон. н