Способ определения активности лейцинаминотрансферазы

 

Изобретение относится к биохимии и предназначено для определения активности L-лейцин-аминотрансферазы . Цель изобретения- - ускорение способа и определение активности I,-лейцин-аминотрансферазы ЛАТ) в биологических жидкостях. Исследуемый материал помещают в смесь, содержащую- - 20-30 мМ L,-лейцина, 15-21 тоглутаровой кислоты и 100-150 нМ пиридоксальфосфата. Готовят еще контрольную пробу, содержащую все компоненты , кроме лейдина. Инкубацию проб проводят при рН 7,6-8,2 в течение 1ч. Затем добавляют раствор 2,4-динитрофенилгидразина в I н НС1 и через 20 мин раствор едкого натра . Через 10 мин фотометрируют. Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по пировиноградной кислоте . По п. 2 ф.. инкубац1-по проводят при концентрации С кетоглутаровой кислоты 2,5-3,5 мМ и пиридоксальфосфата 100-150 нМ. i (Л t49 СО vl со Од

Заесе

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

„„SU„„luZezS цц 4 С О1 М 33/48, А 61 В 10/00 (21 ) 3655258/28-14 (22) 18. 08. 83 (46) 15.06.86. Бюл. N - 22 (7l) Ереванский институт усовершенствования врачей (72) Д.A.ÃåBoðêÿí, И.Л.Саакян и П.С.Симаворян (53) 543.866(088.8) (56) Сар ccino С,С. Kadowaki Н., Кпох M,Å. "Assay of leucine aminotransferase in rat tissues and tumora", Enzyme, 1978, v. 23, рр. 328336. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ЛЕЙЦИН-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимии и предназначено для определения активности t -лейцин аминотрансферазы. Цель изобретения — ускорение способа и определение активности 1, -лейцин-аминотрансферазы 1ЛАТ) в биологических жидкостях ° Исследуемый материал помещают в смесь, содержащую

20-30 мМ „ -лейцина, 15-21 мМ -кетоглутаровой кислоты и 100-150 нМ пиридоксальфосфата, Готовят еще контрольную пробу, содержащую все компоненты, кроме лейцина. Инкубацию проб проводят при рН 7,6-8,2 в течение 1 ч. Затем добавляют раствор

2,4-динитрофенилгидразина в 1 í HCI и через 20 мин раствор едкого натра. Через 10 мин фотометрируют. Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по пировиноградной кислоте. По и ° 2 ф, инкубацию проводят при концентрации А;кетоглутаровой кислоты 2,5-3,5 мМ и пиридоксальфосфата 100-150 нМ.

l 237976

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к биохимии, и может быть использовано как в клинике, так и в эксперименте для определения активности !„ -лейцин:

2-оксоглутарат аминотрансферазы (КФ 2.6 ° 1.6) в сыворотке или в плазме крови, моче, перитонеальной жидкости и в тканевых гомогенатах.

Пель изоб1Ытения - ускорение способа и определение активности L --лей,цин-аминотрансферазы (ЛАТ) в биолог веских жидкостях,, Ф

Пример 1. Берут навеску поджелудочной железы 1 r добавляют

9 мл натрийфосфатного буфера рН 7,8, получая таким образом 10%-ный гомогент, 0,2 мл гомогента.добавляют в инкубационную смесь, содержащую

25 мМ -лейцина, 18 мИ О -кетоглутаровой кислоты и 125 иМ пиридоксальфосфата (общий объем инкубационной смеси 0,8 мл). Одновременно готовят

I контрольную пробу, содержащую все компоненты, кроме лейцина. Инкубацию опытной и контрольной проб проводят в термостате при 37 С 1 ч, о

Реакцию останавливают кипячением в течение 5 мин (эта операция не обя; зательна и выполняется при необходимости дальнейшего хранения проб).

Затем добавляют 0,5 мл 0,020 раствора 2,4-динитрофенилгидраэина в lн.

НС! и через.20 мин с5 мл 0,4 н, раствора едкого натра и через 10 минут фотометрируют при длине волны 510 нм против холостой пробы, содержащей

0 8 мл дистиллированной воды, 0 5 мл

0,027-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина и 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра, Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по пировиноградной кислоте, Активность

ЛАТ определяют по формуле A=(C<-С )х

<50 >l,1, где A — активность ЛАТ в микромолях -кетоизокапроновой кислоты за 1 ч на 1 r ткани, С вЂ” количество пировиноградной кислоты, найденное по калибровочному графику в опытном образце, С - количество пи- ровиноградной кислоты в контрольном образце, 50 — коэффициент пересчета на 1 г ткани," 1,1 — коэффициент пересчета от концентрации пировиноградной кислоты к концентрацииф,-»êåòîèçoкапроновой кислоты, найденный эмпирически, А=(С„-C2) 10 1,1 где А — активность ЛАТ в микромолях ж-кетоизокапроновой кислоты в 1 мл сыворотки (плаэ35 мы) за 1 ч, С, — количество пировиноградной кислоты в микромолях, найденное для опытного образца;

C> — количество пировиноградной кислоты в контрольном образце !

Π— коэффициент пересчета на

1 мл сыворотки (плазмы );

1,1 — коэффипиепт пересчета от пировиноградной к сС кетоизокапроновой кислоте, найденной эмпирически.

В данном случае A=(0,285-0,240)х

s 10 1,1=0,495 микромолей ф-кетоизокапроновой кислоты/мл/ч, Пример 3. Берут О;1 мл мочи человека и проводят операции те же, что в примере 2, Рас.чет ведут по той же формуле. В данном случае A=

=(0,223-0,201) 10 1,1=0,242 микромолей/мл/ ч.

Пример 4. Берут 0,1 мл перитопеальной жидкости и проводят

В данном случае A=(0,337-0,237)"

>50" 1,1=5 5 мкмолей/г ткани/ч.

Пример 2, Берут 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови человека, инку5 H M c T H 25 MN L -лейцина, 3 MM g -кетоглутаровой кислоты и

125 нР(пиридоксальфосфата (общий объем пробы 0,7 мл) в натрийфосфатном буфере, рН 7,8 в термостате при

37 С в течение 1 ч, Одновременно проводят инкубацию контрольной пробы, не содержащей лейцина ° Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл

0,027-ного раствора 2,4-динитрофенил-!

5 гидразина в 1 н, HCI (при необходимости хранения проб проводят предварительно кипячение в течение 5 мин), оставляют на 20 мин, затем добавляют 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра

20 и через 10 мин фотометрируют при длине волны 510 нм против холостой пробы, содержащей 0,7 мл воды, 0 5 мл

0,020 раствора 2,4-динитрофенилгидразина и 5 мл 0 4 н, раствора едкого натра, По экстинкциям из калибровочного графика, построенного по пировиноградной кислоте, находят соответствующие концентрации пировиноградной кислоты и рассчитывают активЗО ность ЛАТ по формуле

123?976

-динитрофенилгидразонов кетокислот, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, инкубацию проводят при рН 7,6-8,2, концентрации Ь -лейцина 20-30 мИ и с6-кетоглутаройой кислоты 15-21 мМ, 2. Способ определения активнос-. ти лейцин-аминотрансферазы по и. 1, отличающийся тем, что, с целью определения активности фермента в биологических жидкостях, инкубацию проводят при концентраций. ос-кетоглутаровой кислоты 2,5-3,5 мМ и лиридоксальфосфата,100-150 нМ, те же операции, что и в примере 2, Расчет ведут по той же формуле.В данном случае A=(0,345-0,200) ° !О к l,1=1,595 микромолей/мл/ч, Формула изобретения

l. Способ определения активности лейцин-аминотрансферазы путем инкубации ткани в присутствии t, -лейцина,сС -кетоглутаровой кислоты и пиридоксальфосфата с последующим добавлением 2,4-динитрофенилгидразина и фотометрическим определением 2,4Составитель Н. Гуляева

Редактор Н,Горват Техред Л.Сердюкова 1 орректор А. Зимокосов

Заказ 3283/45 Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий!

l3035, Москва, Ж-35, Раушская наб °, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,. 4