Способ получения ауксотрофных мутантов бактерий

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А "( (50 4 С 12 N 15 00

9! 1; ь \

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3781721/28-14 . (22) 18.08.84 (46) 30.10.87. Бюл. N 40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумной институт "Микроб" (72) А.Н.Куличенко (53) 575 ° 1(088.8)

{56) Adelberg Е.А. Mandel M. CheinChirgchen G-Biochem. Biophys. Res

Commun. 1965, 18, У 5-6, р.788-795. (54)(57) СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ АУКСОТРОФНЫХ МУТАНТОВ БАКТЕРИЙ, включающий культивирование бактерий в присутствии нитрозогуанидина с последующей инактивацией мутагена, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускоре,ния способа, ., нитрозогуанидин инактивируют путем добавления к взвеси бактерий в растворе мутагена щелочного раствора унитола до конечной концентрации 0,25-0,5Е.

5785.1 128

Изобретение относится к микробиологии, а именно, к генетике микроорганизмов.

Целью изобретения является ускорение способа.

Способ осуществляют следующим образом. Обрабатывают бактерии нитрозогуанидином (НГ), затем к суспензии бактерий в растворе.мутагена добавляют щелочной раствор унитола до конечной концентрации 0,25-0,5Х. Через

3-5 мин нитрозогуанидин полностью инактивируется.

Способ обработки на бактериях семейства Entегоbacteriaceae, в том числе на Yersinia pestis, удобен при работе с вирулентными микроорганизмами.

Пример 1. Получение len мутантов штамма Е. coli С-600 (leu, thr, thi) . Обработку бактерий Е.coli

С-600 нитрозогуанидином (НГ) проводят в 2 мл 0,2 н ацетатном буфере при рН 5,5. Время обработки 20-30 мин, концентрации мутагена 0,3-1,0 мг/мл.

После этапа обработки бактерий нитрозогуанидином к 2 мл суспензии клеток в растворе мутагена прибавляют равный объем 1Z-ного раствора унитиола (до конечной концентрации 0,5X) и

0,5 мл 0,1 н раствора NaOH.Ñïóñòÿ

3-5 мин производят высев культуры на агар с минимальной средой (без

4лейцина) для выявления 1еп мутантов.

Пример 2. Получение ауксо— трофных мутантов штамма чумного микроба.

Бактерии обрабатывают нитрозогуанидином, как в примере 1. После мутагенной обработки к 2 мл суспензии бактерий в растворе нитрозогуанидина добавляют 2 мл 1X — íoão раствора унитиола в щелочном бульоне Хоттингера (для приготовления щелочного бульона и 15 мл бульона добавляют

0,4 мл 1 н раствора NaÎH), рН конечной смеси после добавления раствора унитиола должна быть равна 7,2. Затем проводят этап фенотипической экспрессии мутантов: бактерии подращивают в полученном после добавления унитиола растворе в течение 14 ч, после чего высевают на плотную питательную среду (агар Хоттингера) для получения изолированных колоний, которые дентифицируют по питательным потребностям.

Пример 3. Проверка возможной мутагенности продуктов взаимодействия нитрозогуанидин с унитолом.

В опыте использовали штамм Salm.

typhimurium ТА 100(8), обладающий относительно высокой частотой спонтанных мутаций, вследствие наличия мутагенных свойств у общепринятых питательных сред, и использующийся специально для выявления мутагенности, которая оценивается по частоте реверсии от his к Ь|з+. Штамм несет мутацию типа замены оснований, аналогичные изменения ДНК в основном вызывает и нитрозогуанидин.

Готовили разведения нитрозогуанидина в ацетатном буфере (рН 5,5) с концентрацией НГ 1,0, О,1, 0,001 мг/мл. К растворам нитрозогуа— нидина добавляли раствор унитиола в синтетической среде до получения ко— нечной концентрации унитиола 0,25Х. и 0,1 н раствор NaOH для достижения

25 рН 7,2, .Смесь выдерживали 2-3 мин и вносили 1 каплю односуточной культуры штамма Salm. 1:yphimurium ТА 100.

Параллельно культуру вносили в про,бирки с растворами нитрозогуанидина

3Q без унитиола (вместо унитиола добавляли синтетическую среду) и в пробирки с раствором унитиола без нитрозогуанидина. Через 2 суток отмечали рост в пробирках и делали высев на чашки с синтетической средой (8) для подсчета his+ ревертантов и определения уровня мутагенеза.

Продукты инактивации нитрозогуанидина унитиолом (при нормализации рН

40 среды) не оказывают на клетки леталь ного действия, и они способны расти и размножаться в смеси НГ с унитиолом. Результаты изучения мутагенности для клеток продуктов инактивации

45 НГ унитиолом свидетельствует об от— сутствии таковой. Так, частота образования мутантов бактерий, выросших в смеси, полученной после инактивации НГ унитиолом, в том числе и при заведомо высокой концентрации НГ (1,0 мг/мл), практически не превышает частоту образования мутантов, выросших в присутствии одного унитиола. В то же время у клеток, выросших в присутствии не инактивированного

НГ (концентрация НГ 0,001 мг/мл максимальная концентрация мутагена, при которой имеют место рост и размножение бактерий данного штамма) Составитель Н.Кузенкова

Техред И.Попович Корректор А.Обручар

Редактор А.Купрякова

5204 Тираж 499

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

I13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Заказ

Производственно †полиграфическ предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 1285785

4 частота образования мутантов возрос- центрации последнего 0,257) не облала почти в Iá раз по сравнению с дают мутагенной активностью. клетками, выросшими в присутствии Использование предлагаемого спосоинактивированного унитиола нитрозо- ба по сравнению с известным обеспечи5 гуанидином. вает следующие преимущества: позволяет экономить время (30-40 мин на

Таким образом, можно сделать за- пробу), не требует эксплуатации центключение, что продукты инактивации рифуги, что приводит к зкономии элекнитрозогуанидина унитиолом (при кон в троэнергии.