Фагово-плазмидный вектор @ 131 и способ его конструирования

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генной инженерии , и представляет собой фагово-плазмидный вектор (ФПВ)А pMYF 131 для прямого отбора рекомбинатных молекул ДНК, их генетического анализа и способ его конструирования. Цель изобретения - создание ФПВ с повьшенной эффективностью клонирования, позволяющего упростить процесс получения банков генов и облегчить физический и генетический анализ рекомбинатных клонов. Для этого из предшественника ФПВ удаляют часть молекулы ДНК, не содержащей генов, существенных для развития фага. В результате размер векторной молекулы ДНК становится меньше критического размера, необходимого для упаковки в фаговый капсид. Для поддержания векторной молекулы дак в клетке фрагмент, содержащий все гены и участки ДНК, существенные для развития фага, соединен с фрагментом плазмидной ДНК. Этот фрагмент обеспечивает автономную репликацию ФПВ в клетке, возможность селекции клеток. Фрагменты ДНК, содержащие существенные гены для фагового развития , участок инициации плазмидной репликации и ген устойчивости к антибиотику , не содержат сайтов расщепления для ряда рестриктаз. Введение уникальных сайтов расщепления для этих рестриктаз сообщает полученной молекуле ДНК свойства вектора для ФВПАрМУР 131. 2 с.п. ф-лы; 2 табл. § О) to 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН g 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21 ) 3 926455/28-1 4 (22) 09. 07. 85 (46) 30. 12. 86. Бюл. ¹ 48 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промьппленных микроорганизмов (72).Н.К.Янковский, M.Ф.Фонштейн, Л.M.Åðìàêîâà и В.Г.Дебабов (53) 5?5, 173 (088.8) (56) Loenen W. А.М, Brammar W.Т.

А bacteriophage lambda vector for

cloning 1arge DNA fragments made

with several restriction ensymes. ene, 1980, 10(3),249.

Brenner S.Т, Cesareni Т, Karn Т.

Phasmids hibrids between C0SKI plasmids and Е. coli bacteriopkage lambda. Gene, 1982,17,27.

},54) ФАГОВО-ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР р MYF

131 И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой фагово-плазмидный вектор (ФПВ) $ pNYF 131 для прямого отбора рекомбинатных молекул

ДНК, их генетического анализа и способ его конструирования. Цель изобретения — создание ФПВ с повышенной

„„SU„„128 009 А1 эффективностью клонирования, позволяющего упростить процесс получения банков генов и облегчить физический и генетический анализ рекомбинатных клонов. Для этого из предшественника

ФПВ удаляют часть молекулы ДНК, не содержащей генов, существенных для развития фага. В результате размер векторной молекулы ДНК становится меньше критического размера, необходимого для упаковки в фаговый капсид.

Для поддержания векторной молекулы

ДНК в клетке фрагмент, содержащий все гены и участки ДНК, существенные для развития фага, соединен с фрагментом плазмидной ДНК. Этот фрагмент обеспечивает автономную репликацию

ФПВ в клетке, возможность селекции клеток. Фрагменты ДНК, содержащие существенные гены для фагового развития, участок инициации плазмидной репликации и ген устойчивости к антибиотику, не содержат сайтов расщепления для ряда рестриктаз. Введение уникальных сайтов расщепления для этих рестриктаз сообщает полученной молекуле ДНК свойства вектора для

ФВП Л рМУР 131. 2 с. п. ф-лы; 2 табл.

1 2еО0О

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой фаговоплазмндный вектор (ФПВ} А pMYF 131 для прямого отбора рекомбинантных молекул

ДНК, их генетического анализа и спо-. соб его конструирования.

Целью изобретения является создание вектора с повышенной эффективнос-10 тью клонирования, позволяющего упростить процесс получения банков генов и облегчить физический и генетический анализ рекомбинантиых клонов.

Поставленная цель достигается тем„ 15 что из предшественника ФПВ удалили части молекулы ДНК, не содержащей генов, существенных для развития фага, Размер векторной молекулы ДНК в результате удаления этого фрагмента дол- 70 жен быть меньше критического размера, необходимого для упаковки з фаговый капсид. Полученный вектор не способен осуществлять литический цикл развития фага. Поэтому для поддержания вектор- 25 ной молекулы ДНК в клетке фрагмент, содержащий все гены и участки. ДНК, существенные для развития фага, соединен с фрагмейтом плазмидной ДНК.

Этот фрагмент обеспечивает автономную 36 репликацию (ФПВ) в клетке, возможность селекции клеток, содержащих векторную молекулу в плазмидной форме по маркеру устойчивости к ампициллину плазмиды pUC19. Фрагменты ДНК, ссдержащие существенные гены для фагового развития, участок инициации плаэмидной репликации и ген устойчивости к антибиотику, выбраны таким образом, что не содержат сайтов расщепления для ряда 40 рестриктаз. Введение уникальных сайтов расщепления для этих рестриктаз сообщает полученной молекуле ДНК свойства вектора для ФПВ Л рМУЕ 131 .

ФПВ состоит из следующих элементов.д

Гены и регуляторные области, необходимые и достаточные для лятического цикла развития фага, в том числе левое плечо ДНК фага М 47АВ от участка m (координата О т.п.н) до сайта расщепления рестриктазой Sma I (координата 19,3 т.п.н), правое плечо ДНК вегетативного фага 4 gtNES от сайта расщепления BBIB HI (координата

34,5 т.п.н.) до участка m (координа- 55. та 48,5 т.п.н.), координаты приведены по )PK фага дикого типа.

Ген С1, кодирующий термочувствительный белок-репрессор фага А, с му9 2 тацией 857. Присутствие ts-мутации в гене репрессора С1 позволяет индуцировать фаговую репликацию при повышении температуры. Э.. о обеспечивает простой и эффективный способ амплификации как векторнок ДНК, так и ДНК рекомбинантных на с снове ФПВ. Упомянутая амплификация увеличивает копийность ДНК в 20-50 раз. Такая амплификация может быть примекена для облеr emèÿ выделения ДНК-вектора и гибридов на его основе.

Присутствие ts-мутации в гене С 1 обеспечивает большую безопасность при работе с рекомбинангными ДНК на основе ФПВ, поскольку при температуре выше 37 С невозможно поддержание ФПВ в плазмидной форме, и клетки, содержащие плазмиду,, гиб яут.

Chi — сайт в гене Т фагаА, необходи ъ и для получения высоко го титра фага в отсутствие продуктов генов

red u gam.

Гены Л,В и S в амбер-форме, что позволяет литическое развитие ФПВ на основе ), pNYF ".31 только на штаммах

Е. cali, содержащих имбер — супрессор

SUP . Наличие амбер- мутаций ограничивает литическое раз итие рекомбинантных ФПВ в подавляющем большинстве природных штаммов, увствительных к фагуЛ . Мутация в гене S удлиняет период репликации ДНК ФПВ после индукции фагоспецифиче ской репликации, что позволяет увеличить количество выделяемой ДНК ФПВ, и рекомбинантных молекул ДНК на егo основе. Мутация в гене А препяTròâóeò Hàäðeэанию сверхскрученных молекул ДНК, накапливающихся после индукции фагоспецифической реплккации, что позволяет использовать для выделения ДНК методы выделен ия плаэ мидной ДНК.

Участок индикации репликации (ori) плазмиды pUC19,, исходно содержащийся в плаэмиде рИВХ, размером

О, б т. и., н „Присутствие ori обеспечи- вает поддержание век ."орной молекулы в плазмидной фо рме, .>ффективное установление лизогенного (плазмидного) состояния при инфицировании клеток фаговыми частицами, содержащими гибридный ФПВ. Присутсть ие такого репликона, кроме того, об спечивает большую безопасность при работе с. рекомбинантными ДНК на ос:cae ФПВ при повышенной температуре, поскольку при-сутствие ре э ис тентно го гомоиммунного ки расщепления для рестриктаз Есо47 Ш, Xmalil.

Рекомбинантные ФПВ со вставками

ДНК размером не менее 4 т.п.н. по сайтам Есо RI, Sac I, SalGI, Xba I, Есо 47 III и Хаза III способны развиваться подобно недефектному фагу или могут поддерживаться в клетке, содержащей рекомбинантный ФПВ, в плаэ- 35 Т. В несущественмидной форме. ной зоне

Ферменты, образующие фрагменты

ДНК с гомологичными липкими конФерменты, имеющие уникальный участок расщепления на ДНК

g pMYF 131 цами

Есо RI

Gal СТ, Xho Т

ХЬа I, Avr II

Sac

Xma III, Cfr I, Not I

Все ферменты образующие фрагменты ДНК с тупыми" концами

Есо RI

Sal GI

ХЪа I

Sac

Xma III

Есо 47 III

II. В существенной зоне

То же

Nru I

Sna BI

Sac II

Sac II, Bdc II, Нас II

Asu II, Nar I, Mlu I, Bse PI, Asy I Tag I

Msp I, Hinñ PI, Мас II

Asu ТТ

3 12800 профага в индуцированной клетке не способно репрессировать литическое развитие ДНК ФПВ. Это приводит к гибели индуцированных лйзогенных клеток.

Ген  — лактамаэы (размер 1,1 т. п. н), обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину (маркер Ар ) плазмиды pUC19, исходно содержавшийся в транспозе ТпЗ. Присутствие в фазмиде маркера Ар позволяет исполь- 10 эовать данный маркер в качестве селективного или контрольного при комплементационном анализе рекомбинантного ФПВ.

Полилинке р — по следовательно с ть молекулы ДНК, имеющую набор близко расположенных участков расщепления ряда рестриктаз: Hind III, Sph I, Pst I, Sal GI, ХЪа I, Bam HI, Sma I, Kpn I, Sac I, Есо RI, в том числе уникальные участки рестрикции Есо RI, Sac I, SalGI, Xba Т.

Уникальные участки рестрикции, помимо полилинкера, имеются также в не25 существенных для литического развития областях молекулы ДНК ФПВ. Это участПри расщеплении рестриктазой

SalGI возможна встройка в ФПВ фрагментов ДНК, расщепленной рестриктазами 40

Sa1GI, Xho I..

При расщеплении вектора рестриктазой ХЬа I возможна встройка в ФПВ фрагментов ДНК, расщепленной рестриктазами Xba I u Avr II. При расщепле- 45 нии вектора рестриктазой Есо 47 III возможна встройка в ФПВ фрагментов

ДНК, расщепленной рестриктазами с полностью спаренными ("тупыми") концами, которые образуются под действием раз- 50 личных рестриктаз.

Уникальные участки расщепления для рестриктаз Nru I, Sna BI, Sac II и Asu II в областях ДНК ФПВ, существенных для ее развития по литическому 55 пути.

Вставка фрагментов ДНК по укаэанным участкам расщепления обеспечивает большую безопасность при работе с

09 4 рекомбинантными ФПВ благодаря блоку литического развития гибридных ФПВ.

Гибридный ФПВ, полученный подобным образом, способен поддерживаться в клетке лишь в форме плазмиды. При использовании рестриктаэы Nru I u

Sna BI возможна встройка в ФПВ фрагментов ДНК с "тупыми" концами. При использовании рестриктазы Asu II возможно клонирование фрагментов ДНК, полученных под действием рестриктаз

Asu II, Nar I, Mlu I, Bse PI, Асу Т, Tag I, Msp I, Hin Pl, Мае II.

Суммарный размер ФПВ,1 pMYF 131

32 т.п.н. (65K от размера ДНК фага 1 дикого типа).

Клонирующая емкость сконструированного вектора одинакова для каждой из указанных рестриктаз и составляет

4-21 т. п. н.

Анализ векторных свойств g pMYF 131 приведен в табл. 1.

Таблица1

Рестриктазы, которые могут быть использованы при клонировании в 1р MYF 131

5 128

Пример 1. Конструирование

ФПВ, обладающего требуемой структу-. рой, проводится в два этапа.

На первом этапе совместили в составе одной молекулы фаговой ДНК все перечисленные элементы таким образом, чтобы все необходимые участки фаговой

ДНК можно было легко присоединить к плазмидной части. В качестве исходного материала для конструирования использовали ДНК фагового вектора

Я gt MES (j Наш Eam Sam nin 5) и сконструированного нами ранее ФПВ J p

MYF 15 ((47АВ..Лаю)

Предполагалось соединить в составе одной молекулы левый EcoRI — фрагмент g pMYF15 и правый EcoRI — фрагмент фага Я gt MES.) pNYF 131 пред— ставляе т собой гиб ридную моле кулу

ДНК ФПВ, содержащего плазмиду Й AN7, которая утрачивается при дальнейшем конструировании. Из (р NYF 15 в конструируемую молекулу переходит chiсайт из фага J gt MES — область иммунитета фага с геном С1, содержащим мутацию с1857.

В процессе конструирования 1 мкг

ДНК $ gt MES и 0,1 мкг ДНК (р NYF 15, расщепленных рестриктазой Есо Н?, лигировали в объеме 3 мкл, паковали

in vitro в капсид фага (и высевали на газон бактерий Е.coli M3350, ке содержащих амбер-супрессора. На этом газоне могли образовать негативные колонии A p MYF 15 и гибрид, получивший левое плечо ФПВ и правое плечо фага, так как в левом плече ФПВ в составе плазмиды 11 АМ7 содержится ген Sup F, супрессирующий амбер-мутации, присутствующая в геномах фага и4 р NYF 15. Фаг 4 gt MKS и гибрид., содержащий правое плечо ФПВ и левое плечо ф га, не может расти на -..àçîíå бактерий M 3350, так как содержит в своем составе амбер-мутации и не содержит амбер-супрессора. Маркером для обнаружения правого плеча фага

ggt MKS в составе гибридной молекулы является признак иммунностк к фагу

Правое плечо A p NYF 15 определяет иммунитет к фагу 434. Чтобы различить два типа фаговых частиц, выросших на газоне бактерий Ы 3350, их иммунитет проверяли с помощью спот-теста. Иэ фаговых частиц, способных к росту на бактериях 0 358/Jl i 434 и ке способиык к росту на бактериях Q 358 (g) при 30 С, т.е., содержащих область

0009 ь иммунитета фага (gt MKS, выделили

ДНК. По данным ðàcщеплекия рестриктазой Есс RI э-а ДНК соответствовала искомому гибриду между фагами

ЫЕБ и р NYF 15. 0дин иэ полученных клонов обозначенных 4 р NYF 17, использовали для дальнейшего конструирования.

На втором этапе конструирования

Bam HI плечо фазмицы (р MYF 17, содержащее все гены, необходимые для литического развития фага (: Chi-сайт и ген

С1, кодирующий термолабильный распрес- сор (С1 ), соедин или с плазмидой

pUC19, расщепленкой этой же рестриктазой., Плазмида рЬ 19 представляет собой делеционкый вариант плаэмиды

pBR322, содержащий фрагмент lac- оперона Е.coli. Этот фрагмент обеспечивает c - — комплемекткцию ферментативной активности I — галкктозидазы в штаммах, содержащих делецию а N15, таких как например Е. coli TG-1. 1 мкг ДНК

g p NYF 17, выделенной в фаговой форме, расще пле якой рес тр>ж таэой Bam HI, лигировали с 0,,01 мкг плаэмиды pUC 19, расщепленной этой же рестриктазой.

Смесь лигированкых фрагментов ДНК использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli TG1 (P), которые высевали ка среду с пенициллином, содержащую хромо генный субстрат

Х-gal и ИПТГ. Из неокрашенных колоний выделилк гиб ридные плазмиды. Гибридную плазмидную ДН К эдко го из клонов обозначили 4 p NYF 131. Для получения больших количе ств в эк торной ДНК

g p NYF 131 (до 307. зт всей клеточной

ДНК) осуществляют амплификацию ДНК фаэмиды путем термоккдукции фаговой ре пликации.

ФПВ (р MYF 131, конструирование которого описано в пркчере 1, используют для получения векторной ДНК и для создания банкя генов.

Пример 2. ФПВ ДНК трансформировали компе тектные кле тки штамма

Е. coli HB101, являюп,егося recA, Sup

ФПВ содержит амбер-мутации в генах

А и S. Мутация в геке позволяет увеличить время фагсспецифической репликации ФПВ. Мутация в гене А и отсутствие в ФПВ генов red u gam позволяет выделять ФГБ, пользуясь методами выделения сверхскрученных ДНК, поскольку в клетке отсутствуют ферменты rec, l ей систем и белок А, которые могут релаксирэвать реплицирую-, 7 1280009 8 щийся ФПВ ДНК,,В логарифмической куль-. E.coli С600. Средний размер фрагмен туре клеток Е,coli НВ101, содержа- тов хромосомы при выделении превышал щих -ФПВ, индуцировали фаговую репли- 50 т.п.н. Эту ДНК обрабатывали ресткацию, повышая температуру инкубации риктазой Есо М, варьируя количество с 30 до 45 С, и инкубировали при 5 фермента от 2 до 0,02 ед на 1 мкг

45 С в течение 15 мин. Затем культуры ДНК. Два препарата фрагментов ДНК со растили 2 ч при 37 С. Из выросших средним размером 15 т.п.н. лигировали клеток выделяли плаэмидную ДНК в ко- с расщепленным вектором s весовом личестве 1 мкг из 1-2 ° 10 бактериаль- отношении 1: 1.

8 ных клеток, что соответствует 25-50- 10 Данные по эффективности образовакратной амплификации плазмилы. ния гибридных молекул на основе векПример 3. Хромосомную ДНК торов 47.1АВ и g p MYF 131 приведены выделяли иэ ночной культуры клеток в табл.2.

Т а б л и ц а 2

Получение банка генов Е.coli С600

Обработка фер- Хромосомная ментами ДНК, расщепленная Есо RI

Титр фаговых частиц на газоне бактерий

Номер ДНК вектора, мкг и/п р NYF 131 47.IAB

Есо RI лигаза неселек- селективных тивных

QD5003 QD5003 (Р2) 2,2 10

1, 10з

4,5" 10 6,3 10

1,0

1,0 +

1,0 +

0,1 +

1,2 ° 10

0,5 10

0,1

<10

1,0 (10

1,0

7 ° 1У

3,0 10

О,1

П р и м е ч а н и е. 1. На газоне неселективных бактерий способны образовывать негативные колонии как гибридные, так и негибридные фаги. На газоне селективных бактерий способны образовывать негативные колонии только гибридные фаги.

2 . Неселективный штамм бактерий, на котором негибридная фазмида способна к литическому развитию, не существует.

Вектор 47.1АВ позволяет отбирать >О штамм E.coli QD 5003 (Р2). Для контфаги, содержащие только гибридные мо- роля общего количества фаговых часлекулы ДНК, из смеси гибридных и не- тиц в популяции смесь фагов высевают гибридных фагов, образующихся после на газон бактерий QD5003, на котором упаковки молекул ДНК, полученных в образуют негативные колонии как гибрезультате лигирования векторной и ридные, так и негибридные фаги. клонированной ДНК. На газоне бакте- Реэультаты, приведенные в строке рий, содержащих профаг Р2, образуют 1 колонки 6 (табл.2), характеризуют негативные колонии только гибридные качество ДНК вектора 447.1 и качестфаги. В данном случае используется во смеси для упаковки ДНК. Строка 2

9 12В000 колонки 6 характеризует эффективность расщепления молекул ДНК вектора рестриктазой ЕсoRl. Эффективность упаковки составляет после расщепления

2,1 ° 10, т.е. падает на три порядка по сравнению с эффективностью упаковки нативной ДНК.

Строка 3 колонки 6 характеризует качество векторной молекулы ДНК и использованных ферментов — рестрикта- 10 эы и лигазы. Титр фаговых частиц по"ле лигирования молекул ДНК вектора

347 1АВ составляет 4,5 10 з (строка 3 колонки 6),, т. е. поднимается в

200 раз и составляет примерно 20 i от титра при упаковке нерасщепленной

ДНК (2,2 10, строка колонки 6), Колонка 7 строка 3 характеризует уровень фона — титр негибридных час-.тиц, полученных после упаковки рас- 20 щегленной и лигированной ДНК вектора

) 47. 1АВ и способчых образовывать негативные колонии на газоне селектив ных бактерий QD 5003 (Р2). В данном примере фон составил 6,3 10 .

Иэ строки 3 колонки 6 следует, что одна из примерно 700 (0,1 0) расщепленных и лигированньгх молекул векторной ДНК;147. 1АВ способна образовывать негативную колонию на селективном газоне несмотря на отсутствие в лигируемой смеси чужеродной ДНК.

Строка 4 характеризует эффективность образования гибридных молекул

ДНК при использовании вектора i147.1АВ.

На селективном газоне титр фаговых частиц составил 0,5 ° 1lO (колонка 7), что соответствует эффективности клонирования 5 ° 10з гибридных фагов на мкг ДНК вектора ) 47. 1АВ. Отношение титров на селективном газоне (колонка 7, титр 0,,5 10 ) и несе.лективном газоне (колонка б, титр 1,2 "10 ) ха-рактеризует долю гибридных молекул

ДНК в лигированной смеси молекул векторной и клонируемой ДНК. Доля гибридных молекул составляет окола 47 .от всех упаксванных молекул лигированной смеси. Качество банка, полу-ченного на основе вектора прототипа

$47,1АВ, характеризуется долей негиб-. ридных молекул в лигированнай смеси, способных образовывать негативные колонии после упаковки и высева на газон селективных бактерий. В данном примере доля негибридных фагов, образующих негативные колонки в селективных условиях (строка 3 коленки 7, 10 с,; титр 6,3 10 при мкг), .от всех фагов, пс луче нных при упаковке лигированной смеси ДНК, образующих колонии в селективных услсвиях (строка 4 колонки 7, 0,5 10 гри 0,1 мкг), составляет 12 /

Свойства предлагаемого ФПВ ) р NYF

131 характеризуются строками 5,6 и 7.

Строка 5 характеризует качество нативной век-орной молекулы ДНК 1 р

NYF 131. Титр фагов, образуемых при упаковке нативной плазмидной формы о

ФПВ, сî".òàâëÿåò менее 10 на 1 мкг упаковываемой ДНК вектора. Контролем качества упаковочной смеси является определенный параллельно титр упако— ванной нативной ДН < вектора $ 47.1АВ (строка 1 колонки 6, 2,2 ° 10 ) . Таким образом,, менее чем 1 из 10 молекул

6 нативного ФПВ A р М F 131 способна к упаковке и образованию негативной кодонни, Строка 6 характеризует уровень фона †. титр не гибридных частиц, полученных после упаковки расщепленной и лигированной ДНК вектора Я р MYF 131, способньс образовать негативные колопии на газоне бактср Ф. Титры негибридных частиц состсвляют менее 1 на

1 мкг упакованной, расщепленной и лигированной ДНК ФПБ, 1, р IYF 131 (строка

6 колонки 6, титр с10 ). Аналогичный показа. тель фона дл вектора прототипа и базового o6pa=-ца Р 47. 1АВ (строка 3 колонки 7, титр 6,3 . t02 ) выше показателя фона для заявляемого ФПВ, более чем в 63С раз. Таким образом

ФПВ по сравнению с вектором-прототипом и базовым образцом характеризуется в 630 раз более низким фоном.

Строка 7 характе авизует эффективность образования гибридных молекул

ДНК с помощью заявле.нного ФПВ 1 р MYF

131. После упаковки смеси расщепленной и лигированной (IHK ФПВ и клонируемой ДНК титр фаговых частиц составил 3,0 .10 (строка 7 колонки 6), что coîтветствует осразованию 3,0х х10 фаговых частиц на 1 мкг ФПВ.

Качество банка, полученного на основе Ф1Б,1 р MYF 131, характеризуется долей негибридных молекул в лигированной смеси, способных образовывать негативные колонии после упаковки и высева на газон бактерий. В данном примере доля негибридных 4 р NYF 131, образующих негативны. колонии на газоне бактерий (строка 6 колонки 6, 1280009

11 титр <10 на 1 мкг ДНК), от всех

ФПВ, полученных при упаковке лигированной смеси ДНК и образующих негативные колонии (строка 7 колонки 6, титр 3,0>10 на 0,1 мкг ДНК), состав- 5 ляет менее 10 (0,003 ).

Сравнение качества банка, полученного. на основе вектора-прототипа и 47.1АВ (доля негибридных фагов 12 .), с качеством банка, полученного на ос- 10 нове предлагаемого 1 р NYF 131 (доля негибридных фазмид менее 0,003 ), показывает, что качество банка на основе предлагаемого вектора значительно выше — доля негибридных частиц в 15 банке, полученном на основе ФПВ

)р MYF 131, по крайней мере в 4000 раз меньше, чем в банке, полученном на основе вектора-прототипа.

Таким образом, по двум взаимосвя- 20 занным параметрам (уровню фона и качеству банка) предлагаемый ФПВ р MYF 131 значительно превосходит вектор-прототип 47. 1.АВ. В плане практической работы по конструированию банков генов это превосходство выражается в гораздо меньшей вероятности получения ложного банка — популяции негибридных бляшкообразующих частиц, полученных после упаковки 30 смеси расщепленной и лигированной

ДНК вектора и клонируемой ДНК.

Сравнение эффективности образования гибридных молекул ДНК на основе предлагаемого ФПВ р МУР 131 (строка

7 колонки б, титр 3,0" 1О на 0,1 мкг

ДНК вектора) и на основе векторапрототипа и базового образца 47.1АВ (строка 4 колонки 7, титр 0,5;10 на-.

0,1 мкг ДНК вектора) показывает, что. 40 эффективность образования гибридных молекул на основе предлагаемого векТора ) р MYF 131 в данном примере в б раз выше.

В плане практической работы по конструированию банков генов это превосходство предлагаемого вектора выражается в большем количестве гибридных молекул, получаемых в расчете на оди- 50 каковое количество клонируемой ДНК.

Пример 4. Использование гибридного ФПВ $ р MYF 131 для генетического анализа. Проведен поиск генов комплементирующих мутаций aro G u

pro А Е.coli. Обнаружение указанных генов необходимо для конструирования микроорганизмов — продуцентов аминокислот.

12

Банк генов Е. coli получен для обнаружения в нем ФПВ, несущих ген aro С.

Одновременно определяет частоту встречаемости ФПВ, несущих гены пролинового оперона. Поиск ФПВ, содержащих искомые гены, проводили с помощью комплементации соответствующих ауксотроф" ных мутаций бактерий штамма Е.coli

АВ3252 pro А, aro G. Инфицированные

ФПВ клетки высевали на селективные среды, содержащие пенициллин, а также стрептомицин, являющийся селективным маркером реципиентного штамма, и не содержащие либо пролин, либо ароматические аминокислоты — триптофан, тирозин и фенилаланин.

Титр популяции ФПВ составлял 3,1х х10 фаговых частиц. Титр трансдуктантов, выросших на полной среде с пенициллином, равнялся 4,5 10 при множественности инфекции нри трансдукции 1 фаговая частица íà 10 бактерий.

Эффективность трансдукции пенициллинового маркера популяцией гибридных фаговых частиц составила 15 Х. Доля

Ар колоний, прототрофных по пролину, среди всех Ар" колоний составила 1,7х х10 . Для колоний, прототрофных по триптофану, тирозину и фенилаланину, эта величина составляла О 3-10 ..

t э

Из колоний Ар, aro G выделили плазмидную ДНК, как описано в примере

3. ДНК упаковали xn vitro в капсид фага, как описано в примере 3, и высеяли на газон чувствительных бактерий. Из отдельных фаговых колоний получили препараты фагов высокого титра, которые трансдуцировали маркер aro С сцепленно (1ООХ) с маркером

Ар

Таким образом, получены гибридные фазмиды, производные,1 р MYF 131, содержащие искомый ген aro G.

Предлагаемый вектор 1 р MYF 131 является первым ФПВ, который можно использовать для получения популяции только гибридных молекул благодаря новому принципу для фаговых векторов — дополнению генома фазмиды до пакуемого размера.

Формула изобретения

1. Фагово-плазмидный вектор, предназначенный для получения и анализа банка генов, имеет размер молекулы

33 т.п.н. и состоит из следующих элементов:

Составитель Н. Куэеякова

Редактор Л.Веселовская Техред Л.Сердюкова Корректор А.Тлско

Заказ 268 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, уп. Проектная, 4

13 1? 800

Гены и регуляторные области, необходимые и достаточные для литического цикла развития фага 1, в том числе левое плечо ДНК вегетативного фага ) 47.1АВ от участка m (координата 0 т.п.н.) до сайта расщепления рестриктазой Sma I (координата f9.3 т.п .н.), правое плечо ДНК вегетативного 1 gt MES от сайта расщегления

Bam HI (координата 34,5 т.п.н.) до 10 участка m (êîoðäèíàòà 48,5 т.п.н.),, координаты приведены по ДНК фага/ дикого типа.

Участок инициации репликации (оri) из плазмиды pUC 19 размером 0,6 т.п.н. 15

Ген р вЂ,лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину

{маркер Ap, размер 1,1 т=п.н.) из плазмиды pUC 19.

Полилинкер — последовательность 20 молекулы ДНК, имеющая набор близко расположенных участков расщепления ряда рестриктаз: Hind III, Sph

Pst I, Sal GI, ХЬа I, Bam HI, Sma

Kpn I, Sac I Eco RI в том числе уникального участка рестрикции: Есо

RI, Sac I, Sal GI, ХЬа I, Уникальные участки рестрикции в несущественных для литического развития областях фагово-плазмидноro вектора: Есо 47 III, Xma III.

Уникальные участки расщепления для рестриктаз Nru Т, Sna BI, Sac II, Asu II в областях фагсво-плазмидного вектора, существенных для ее развития 35 по литическому пути.

Ген с 1, кодирующий термочувствительный белок-репрессор фаг, с мутацией 857.

СЬi — сайт в гене Г фага ), необ- 40 ходимый для получения высокого титра

09 !4 фага в отсутсTBHr продуктов гена гесс и 8ап1.

Гены А, Б и S в амбер-форме, что позволяет литическое развитие фаговоплазмидного вектора и его гибридов только на штаммах Е. со11, содержащих

P амбер-су-прессор Епр

Емкость вектора одинакова для каждой из указанных рестриктаз и составляе т 7 — 21 т. п. и.

Возможными хо=- яевами для плазмид— ного размножения фагово-плазмидного вектора g р МУР 131 являются штаммы

Е.cali, адсорбирующие фаг, в которых может происходить репликация coli-подобных плазмид; t актерии TG 1 (g ) .

2. Способ конс груирования фаговоплазмидного векто.1а 1 р NYF 131, предназначенного для получения и анализа банков генов, заключающийся в том, что ДНК фага 1 47.1А13 и плазмиды

JlaN 7 расщепляют рестриктазой Cfr 91, лигируют, упаковывают 1п vitro и высрВагог Ha пермисснвный газон E coll.

И 3350, полученный гибрид 3 р NYF 15, содержащий встройку плазмиды в левый сайт расщегления СЕг 91, гидролизуют эндонуклеазой Есо RI и лигируют с расщепленным этой же эндонуклеазой фагом ), gt ЖЕБ, уп ковывают 1п у йго, отбирают по маркерам правого плеча фага, gt УЕВ (imm 1 ) и плазмиды 4faN 7 (sup F), этот гибрид названный3 р MYF

17, расщепляют рестриктазой Ваш HI u лигируют с плазмидой pUC19, расщепленной этой же рестриктазой, трансформируют бактерии Е. coii ТС 1 (2) и отбирают по маркеру Ар и термочувствиг тельности (ts), из которых выделяют фа гово-плазмидный гибрид Ар М1У 131.