Способ приготовления трансплантатов органов

 

Изобретение относится к области медицины и касается способа приготовления трансплантатов органов. Цель изобретения - повышение степени сохранения биофизических свойств исходных органов. Для этого изъятые у рыб, птиц и млекопитающих органы обрабатьгеают растворами ди-, -триили поликарбоновых кислот или HsI хлоран идридов, взятыми в концентрации 0,02-3,2% при комнатной температуре в течение 3-48 ч. СО со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУЬЛИК (я) 4 А 61 К 31/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТЪ(ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРе Гений и ОтнРытий (21) 3266255/30-15 (22) 30,03.81 (31) 2529/80 (32) 31.03.80 (33) СН (46) 15.02.87. Бюл. К- 6 (71) Волько Базель АГ (СН) (72) Вольфганг Фрэфель, Хайнц Феликс Лихти и Массимо Брунетти (СН) (53) 59.089.844(088.8) (56) 1.orgiader F. Organ Transplantation, Gorg Thieme, 1970.

Malter P., Schmitz Н. Der hetегоloge Gefassersatz, Editio Cantor, Aulendorf, 1976.

Sawyer P.Í. et al. Vascular

Grafts Appleton Century Crofts, 1977, р. 282.

„,SU „„1291020 А 5 (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТОВ ОРГАНОВ (57) Изобретение относится к области медицины и касается способа приготовления трансплантатов органов.

Цель изобретения — повьппение степени сохранения биофизических свойств исходных органов. Для этого изъятые у рыб, птиц и млекопитающих органы обрабатывают растворами ди-, .триили поликарбоновых кислот или их хлорануидридов, взятыми в концентрации 0,02-3 2Х при комнатной температуре в течение 3-48 ч.

12910

Изобретение относится к медицине и касается способа приготовления трансплантатов органов.

Целью изобретения является повышение степени сохранения биофизических свойств исходных органов.

Установлено, что путем внутрии/или межмолекулярной сшивки макромолекул межклеточной матрицы органов или частей органов можно в значитель-I0 ной мере сохранить первоначально имеющиеся биофизические свойства (в случае протезов сосудов аксиальную и радиальную эластичность, а также гладкое состояние внутренней поверхности сосудов). Эта сшивка отличается от известных способов тем, что она осуществялется не за счет образования шиффовых оснований, а за счет химически более стабильных амидокислотных связей между аминогруппами, соответств.-чно эа счет сложноэфирных связей спиртовых гидроксильных групп пепгидных целей меж25 клеточной матрицы и карбоксильных групп ди-, три- или поликарбоновой кислоты, которая применяется как средство сшивки„

Предлагаемый способ заключается в том, что органы илн части органов рыб, птиц или млекопитающих„ предпочтительно высших млекопитающих, обрабатывают для сшивки макромолекул межклеточной матрицы за счет образования амидных связей и сложноэфирных связей между аминогруппами, соответственно между спиртовыми гидроксильными группами пептидных цепей и карбоксильными группами ди-, щ три- или поликарбоновых кислот алифатического, циклоалифатического, ароматического или гетероциклического ряда.

Матрицу можно обрабатывать на дополнительной стадии способа диальдегидом. Обработка диальдегидом служит в основном для связывания не охваченных при сшивке аминогрупп. Благодаря этому повышается избыток отрицательного заряда, который, согласно изобретению, снижает опасность по-; явления тромбоза, например, при трансплантации сосудов, В качестве исходного материала применяются, в частности, артерии, вены, сердечные клапаны, а также перикард и т.д., полученные у птиц и высших млекопитающих. Трансплантаты

Z0 2 могут бытЬ получены как у людей (аутологичные трансплантаты), так и у телят, крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней, гусей, индеек, ABsBHoB и других животных (инадекватные трансплантаты). При этом предпочтительны органы и части органов животных из-за их большей доступности, в особенности молодых животных, органы которых обладают превосходной эластичностью.

Органы и части органов тотчас после изъятия освобождают от окружающих тканей, коллатерали перевязывают лигатурой, Затем их подвергают обработке или до обработки хранят в воде, физиологическом растворе поваренной соли или в другом физиологическом водном растворе, например твине ,S0 (полиоксиэтиленовые производные сорбитанолеата), или в неводной жидкости, например диметилсульфоксиде, при 0-15 С с добавлением небольшого количества азида натрия, Обязательной стадией способа является сшивка пеп:...,дных цепей компонентов межклеточной матрицы. Она основана на связывании двух, трех или более аминогрупп (преобалающей частью F -аминогр;.-.-и лизиновых радикалов) соответственно спиртовых гидроксильных групп пептидных цепей алифатическ ми, циклоалифатическими, ароматическими или гетероциклическими ди-, трн- или поликарбоновыми кислотами благодаря амидокислотным или сложноэйирным связям, Из укаэанных карбоновых кислот прежде всего пригодны такие, которые не содержат ни оксогрупп (альдегидных и кетонных групп), ни аминогрупп. В особенности принимают во внимание такие ди-, три- или по- ликарбоновые кислоты, которые не содержат никаких функциональных групп кроме карбоксильных и гидроксильных групп. !

В качестве алифатических дикарбоновых и трикарбоновых кислот предпочтительны соединения с количеством атомов углерода вплоть до IZ т.е. щавелевая, малоновая, янтарная, яблочная, глутаровая, адипиновая, пимелиновая, пробковая, себациновая и додекандикарбоновая, винная и слизевая кислоты, в качестве трикарбоновых кислот — трикарбаллиловая и лимонная кислоты.

1291020

Иэ циклоалифатических ди-, триили поликарбоновых кислот пригодны циклопентадикарбоновые и циклогександикарбоновые кислоты, например циклогексан-1,4-дикарбоновая кисло- 5 та.

B качестве ароматических дикарбоновых кислот в особенности нужно отметить фталевую, изофталевую и терефталевую кислоты,в качестве ароматических трикарбоновых кислот— тримеэиновую и тримеллитовую кислоты.

Из гетероциклических ди-, трии поликарбоновых кислот принимают во внимание фуран-2,5-дикарбоновую, тетрагидрофуран-2,5-декарбоновую кислоты, окисленные крахмалы и карбоксиметилцеллюлозу.

Расстояние между двумя доступными для сшивки -аминогруппами и целесообразная для осуществления способа растворимость в растворителях в случае упомянутых предпочтительных групп требует более узкого нижнего и верхнего предела, Особенно предпочтительны, следовательно, с одной стороны, алифатические дикарбоновые кислоты с 3-12 атомами углерода, т,е. от малоновой до декандикарбоновой кислоты. С другой сторо ны,также оправдывают себя более высокомолекулярные поликарбоновые кислоты, например окисленные крахмалы. 35

Сшивка может достигаться на основании всех применяющихся в химии способов для образования амидной связи между амино- и карбоксильной группой. В частности, со свободными 40 аминогруппами межклеточной матрицы могут вступать во взаимодействие хлорангидриды, азиды или ангидриды указанных карбоновых кислот. Точно так же свободные ди-, три-, поли- 45 карбоновые кислоты могут связываться со свободными аминогруппами межклеточной матрицы с помощью пригодного реагента сочетания (карбодиимиды, например дициклогексилкарбоди- 50 имид).

Реакция, как правило, осуществляется в безводном органи еском раство рителе, таком как тетрагидрофуран, диоксан, пиридин, диметилформамид, диметилацетамид, диметялсульфоксид и гексаметилфосфортриамид, или в смеси двух или более растворителей, Если используется водорастворимьг реагент сочетания, например И-этилf

-N -(3-диметиламинопролил)-карбодиимид-гидрохлорид, то в качестве растворителя пригодна также вода.

Такого рода стабилизированные органы и части органов могут подвергаться дублению или сшивке (факультативной) на второй стадии способа с помощью диальдегида, в результате чего оказывается воздействие на возможно еще свободные аминогруппы коллаген-пептидной цепи с обраэован1 ем шиффовых оснований. Эта обработка предпочтительна также потому, что получающиеся с помощью глутарового диальдегида протезы уже практически стерильны.

B качестве диальдегида пригоден любой диальдегид, предпочтительны формальдегиды, диальдегидкрахмалы и прежде всего глутаровый диальдегид.

Реакция с диальдегидом осуществляется предпочтительно в водном растворе (например, по способу согласно патенту Швейцарии Р 595105 или патенту США Ф 3093439). !

Полученные трансплантаты затем тщательно промывают водой, стерилизуют и хранят вплоть до применения в запаянных пластмассовых мешках, Стерилизацию продуктов осуществляют исключительно химическим путем с помощью пропен-1,2-оксида (см. далее под названием К-1-раствор), пропиолоактона (лактон Р-окси-пропионовой кислоты) или этиленоксида.

Имплантацию протезов осуществляли гибридным собакам весом по 20-25 кг: а) на обеих Arterias femorales каждой собаки дистально паховой связки по методу P.Walter и сотр, (Helv, chir. Acta 46 (1979), 81 и последующие); б) на обоих каротидах; в) на

Aorta abdominalis каудально отхождению Arteria renoles (P.Walter and

Н.Schmitz, Der hetегоlояе Getassersatz, с.30, Editio Condor. Aulendotz, 1976) r) на инфраренальной Vena сача

interior по методу S.Horseh и сотр. (Longenbecks Arch. Chir 344 (1978), 225 и последующие). Для сравнения осуществлялись параллельные опыты с протезами из тефлона (Р) и дакро,на (Р), а также с пупочными венами, которые дубили только с помощью глу- тарового диальдегида. Измеряли про1 2 .> 102

55 я), Стерилизация с помощью пропен-1,2-оксида, Артерии ка 16-24 ч (возможно также и на более длительное время) поцР кт 3 я крытия им««JIянтятя с пуc тя шесть недель.

Место имплантации кя тазобедренном суставе собаки подвергается высокой механической нагрузке. 5

Показательны сравнительные результаты, Имплантаты из тефлона (Р) и

IJmhi1icolvene имеют закрытие 100!, имплянтаты из дакрона (Р) имеют закрытие 777, в то время как предлагаемые имплантяты согласно примеру 9 имеют закрытие 507. Полученные при сравнительных опытах значения статистически достоверны.

В опытах, продолжавшихся в течение 6 мес при физиологиче ки благоприятных условиях, я именно кя Artiring Cacitss процент закрытия им-плянтятов согласно примеру 9 упал до 207 (полученное значение стати- 20 стически достоверно). Бо время опытов, продолжавших я 6 мес в инфрарекялькой области, тромбозов не

«tаблюдали.

Пример 1. Каротиды теленка освобождают от окружающей связующей ткани и перевязывают коллятеряли. После механической препарации их промывают деионизиров;.кной водой. высушивают фильтровальной бумагой, насаживают на стеклянную папочку диаметром, напри«.ер, 3 ..и «« для обез.воживания помещаот в зяпоякеккый тетрагидрофураном мерный цилиндр, Кяждь е 1 — 2 ч содержимое мерного ци- 35 линдра встряхивают, Спустя 5 ч жидкость заменяют новым тетрагидрофураном. Спустя следующие 2-3 ч стеклякную палочку удаля«от.

На следующий день артерии вносят в 27-ный (вес/объем) раствор хлорангидрида адипиновой кислоты в тетрагидрофуране и оставляют в этом растворе 24 ч. Раствор встряхивают или заставляют циркулировать с помощью насоса. После этого артерии помещают в чистый тетрагидрофуран, затем в смесь тетрагидрофураня с водой (1:1 по объему) и наконец в забуференный фосфатом раствор поварекной соли и оставляют в нем на 30-60 мик.

В результате артерии готовы к стерилизации или к гидролизу с помощью фицина, папаиня или тому подобного.

0 6 мешают в 17,-ный (вес/объем) раствор пропек-1,2-оксида в смеси этанола с водой (1:i по объему). Затем их в стерильных условиях помещают в PBSраствор и вместе с ним запаивяют в стерильный пластмассовый мешок.

PBS-раствор готовят следующим образом.

В 40 л воды расторяют 320 r хлористого натрия, Я r хлористого калия, 51,2 г дигидрята вторичного фосфата натрия, 8,0 r первичного фосфата калия, 5,2 г дигидрата хлористого кальция и 4,0 r гексагидрата хлористого магния.

Для хранения артерий в смеси этанола с водой достаточно их поместить в указанный водно-спиртовый раствор пропиленоксида и вместе с жидкостью запаять в пластмассовый мешок. б), Стерилизация с помощью пропиолоактона (лакток р -скси-пропионовой кислоты), Примерно в 900 и« деионизированкой воды растворя.о: следующие соли:

0,236 r хлористого натрия, 0,248 г хлористого калия, 0,363 г дигидрата хлористого кальция, 0,190 г гексагидрата хлористсго магния и 0,172 r первичного фосфята калия ° С помощью примерно О,l к водного раствора едкого натря доводят рН раствора до /,4.

Затем в эя;-:творе растворяют 11,782 г бикарбонятя натрия и объем доводят до 1000 мл путем добавления воды.

Непосредственно перед стерилизацией артерий к 1 л этого раствора добавляют 8,6 мл (10,83 г) кропиолактона, в смесь помещают артерии и запаивают их вместе с жидкостью в пластмассовый мешок. в). Стерилизация с помощью этиленоксида.

Помещенные в раствор PBS или физиологический раствор поваренной соли артерии вместе с жидкостью запаивают в пластмассовом мешке. Стерилиэуют тем, что закрытый пластмассовый мешок в аппарате для стерилизации обрабатывают газообразной окисью этилена 4 ч при 25-30 С.

Пример 2. Четыре механически отпрепарировакные артерии теленка по отдельности насаживают на стеклянные палочки толщиной 4 мм и помещают в заполненный пиридином мерный цилиндр емкостью 500 мл. Спустя час оки становятся настолько жесткими, 1291020 что стеклянные палочки можно вынуть.

Жидкость сливают и заменяют новым пиридином, Спустя час пиридин еще раз обновляют. Спустя еще час артерии вносят н смесь, которая готовит- 5 ся следующим образом: в смесь из

98 мл пиридина и 2 мл диметилформамида при перемешинании вносят шприцем 2 мл (2,5 r) хлорангидрида ади10 пиноной кислоты, при этом образуется мелкий осадок адипилпиридинийхлорида, Когда он отстаивается, его накрывают ситом из Aaphopa. Затем артерии помещают на сито так, чтобы они были полностью покрыты жидкостью, однако не соприкасались с осадком.

Спустя 18 ч артерии вынимают из жидкости и погружают на 30 мин н К-1-раствор (см.пример 6). Затем их промывают четырехкратно 0,05 н стерильным водным раствором уксусной кислоты и дважды стерильным фосфатным буАероМ (1/15 молярным) с рН 8. Их помещают в стерильный PBS-раствор и вместе с этой жидкостью запаивают и пластмассовый мешок.

Пример 3. 10 артерий теленка механически препарируют и на 3 ч помещают ветикально в заполненный тетрагидрофураном мерный цилиндр емкостью 500 мл, Затем их по отдельности помещают в стеклянные трубки шириной примерно 2 см и встряхивают их (каждая с 40 мл 0,067.-ного (вес/ объем) раствора адипиновой кислоты в смеси тетрагидрофурана с водой (4:1 по объему). Спустя 1 ч добанляют по 40 мл 21-ного (вес/объем) раствора дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофуране и путем встряхивания и колебания смешивают с уже имеющимся раствором, Спустя 3 ч артерии помещают в К-1-раствор (см. пример 6), На следующий день их промывают по 40 мл стерильной смеси этанола с водой (1: 1 по объему), стерильного фосфатного буфера (1/15 молярного) с рН 8 и помещают их в стерильный PBS-раствор. Наконец их вместе с PBS-раствором запаивают в пластмассовый мешок.

Пример 4. 10 артерий теленка после механическогс r.„:åràðèðîâàíèÿ помещают в заполненный диметилформамидом мерный цилиндр емкостью

500 мл. Спустя 3 ч их по отдельности помещают в стеклянные трубки с внутренним диаметром примерно 2 см и заливают их по 40 мл 0,067-ного (вес/объем) раствора адипиновой кислоты н смеси пиметилформамида с водой (4:1), Спустя час добавляют по

40 мл 2Х-ного (по объему) раствора дициклогексилкарбодиимида в диметилформамиде и смешивают путем встряхивания и колебания с уже введенным раствором адипиновой кислоты. Спустя 3 ч жидкость из каждой трубки выливают и заменяют по 80 мл К-1-раствора. На следующий день артерии промывают по 40 мл стерильной смеси этанола с водой (1:1 по объему) и стерильного фосфатного буфера (1/15-молярного) с рН 9. Наконец их вносят н стерильный PBS-раствор и вместе с ним запаивают н пластмассовый мешок, Пример 5, 4 артерии теленка освобождают от связующей ткани и перевязывают коллатерали. Затем артерии вносят на 2 ч в 60 мл 0,02X †ного (вес/объем) водного раствора адипиновой кислоты. Затем их помещают и 60 мл водного раствора, который содержит адипиновую кислоту в концентрации 0,2 r на литр и N-этил-N— ,(-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорид в концентрации 25 г на литр. Спустя 20 ч артерии вносят в

К-1-раствор, спустя 24 ч — в стерильный PBS-раствор, Вместе с ним их запаивают в стерильный пластмассовый мешок, Пример 6. Механические препарированные артерии помещают на 2 ч в 60 мл раствора 0,17.-ного (вес/объем) пробковой кислоты в воде, затем в 60 мл водного раствора, который на литр содержит 0,24 г пробковой кислоты и 25 г N-этил-N --(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорида.

Спустя 20 ч артерии вносят в К-1†.раствор, спустя следующие 24 ч — н стерильный PBS-раствор и вместе с ним запаивают в стерильный пластмассовый мешок.

К-1-раствор готовят следующим образом, Смешивают 720 мл воды и 720 мл этанола, К этому раствору добавляют

16,9 мл (14,1 r) пропен-1,2-оксида.

Этот раствор нсегда готовится свежим и используется непосредстненно после приготовления для стерилизации.

П р и и е р 7. Каротиды телят, как описано н примере 1, механически

9, 1291020 препарируют и промывают водой, затем помещают в 200 мл тетрагндрофурана.

Спустя 7 дней артерии помещают в

3 2Х-ный (вес/объем) раствор дихлорангидрида доденкарбоновой кислоты в тетрагидрофуране и оставляют их лежать в нем 48 ч. Затем их помещают на 16 ч в тетрагидрофуран, на 8 ч в буферный раствор тетрагидрофурана (1:1 по объему) с рН 4,5 и на 1 день в водный буферный раствор с рН 4,5. Теперь они готовы к стериl лизации или к гидролизу.

Пример 8. 10 артерий телят после механической обработки помещают в плоскую чашку и заливают 500 мл

1Х-ного раствора лимонной кислоты в воде (вес/объем). Через 2 ч артерии помещают в мерный цилиндр на

500 мл в вертикальном положении и заливают их раствором 0,2 г лимонной

i кислоты и 10 г N-.;òèëåí-N -(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорида в 500 мл воды, Через день артерии промывают в течение 20 мнн в проточной воде и затем помещают в стерильный физиологический раствор поваренной соли. Вместе с физиологическим раствором артерии помещают в пакетики из полимерного материала, пакетики запаивают и стерилизуют окисью этилена, как это описано в примере 1.

Пример 9. 10 артерий телят после механической обработки натягивают на стеклянные стержни и устанавливают в мерный цилиндр на 500 мл, заполненный насыщенным водным раствором DL-камфарной кислоты (DL-1,2,2-триметилциклопентан-1,3-цис-дикарбоновая кислота). Через 4 ч артерии, не снимая их со стержней, помещают в мерный цилиндр на 500 мл и заливают раствором 0,25 г DL-камфарной кислоты и t0 r N-этил-N -(3-диметиламино-пропил)-карбодиимид-гидрохлорида в 500 мл воды. Через 4 ч стержни осторожно вытаскивают иэ артерий, а через день артерии в течение получаса промывают проточной водой, помещают в стерильный физиологический раствор поваренной соли и вместе с ним запаивают в пакеты из полимерного материала, после чего ñðàзу же стерилизуют окисью этилена, как это описано в примере 1.

Пример 10. 100 коллатералей сонных артерий телят и быков длиной

2-4 см каждая укладывают .в химический стакан объемом 200 мл и заливают

200 мл тетрагидрофурана. В течение суток жидкость дважды заменяют свежими порциями. Примерно через каждые.

2 ч содержимое стакана тщательно перемешивают, На следующий день жидкость заменяют на раствор 20 мл/л хлорангидрида адипиновой кислоты и 38 мл/л триэтиламина в тетрагидрофуране. Время от времени стакан переворачивают для перемешивания его содержимого. На следующий день жидкость

15 из стакана сливают и заливают коллатерали 200 мл тетрагидрофурана. Через 2 ч его заменяют на смесь тетрагидрофурана и цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 4,5 в объемном соотношении 1: 1, а еще через

20 2 ч на чистый цитратно-фосфатный буферный раствор с рН 4,5. Через день коллатерали промывают в течение четверти часа проточной водой, помещают в стерильный физиологический раствор поваренной соли в пакет из полимерного материала, пакет запаивают и стерилизуют окисью этилена, как это описано в примере 1, Пример 11. Вырезают из перикарда теленка. 10 круглых кусков диаметром 3 см и выдерживают их в течение получаса в воде. Каждый иэ кусков укладывают на стержнеобразный шаблон диаметром около 8 мм, высту35 пающий примерно на 2 см из пластины.

После этого куски перикарда прижимают со всех сторон в направлении от центра с помощью гладкой моделирую4 щей деревянной палочки к шаблону таким образом, что в результате они принимают форму мешочков диаметром около 8 и высотой примерно 12 сш.

Если шаблоны с надетыми на них кус45 ками перикарда поместить на 20 мин под 100-ваттную нагревательную лампу, то они высыхают и могут быть сняты с шаблонов, сохраняя при этом свою форму. Затем их помещают в хими50 ческий стакан с 150 мл тетрагидрофурана, следя при этом за тем, чтобы они полностью были покрыты жидкостью.

Через 3 и 6 ч тетрагидрофуран в стакане заменяют свежими порциями.

На следующий день тетрагидрофуран заменяют 3,5Х-ным раствором (вес/объем) хлорангидрида додекановой кислоты в тетрагидрофуране и оставляют в нем мешочки из перикарда на 24 ч.!

1291020

Составитель И,Тареева

Редактор М.Циткина ТехредМ.Ходаиич Корректор Т.Колб.

Заказ 7920/60 Тираж 596 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.ужгород, ул,Проектная,4

Затем жидкость в стакане заменяют на чистый тетрагидрофуран, через 4 ч— на смесь тетрагидрофурана и цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 4,5 в объемном соотношении 1: 1, а еще через 4 ч на чистый цитратнофосфатный буферный раствор с рН

4,5. На следующий день мешочки иэ перикарда помещают в физиологический раствор поваренной соли, затем вместе с этим раствором в пакеты из полимерного материала, пакеты запаивают и стерилизуют с помощью окиси этилена. Обработанные таким образом кусочки перикарда можно испольэовать для замены поврежденных барабанных перепонок °

Формула и э обретения

Способ приготовления трансплантатов органов, включающий изъятие органов у животных и обработку их растворами химического реагента,о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения степени сохранения биоf0 физических свойств исходных органов, в качестве химического реагента используют ди-, три- или поликарбоновые кислоты или их хлорангидриды концентрации 0,02-3,27,а обработку ведут при комнатной температуре в течении 3-48 ч.