Способ выделения белковой фракции

 

Изобретение относится к методам фракционирования веществ биологического происхождения и позволяет повысить степень очистки целевого продукта . В электрофоретической камере формируют разделительный буферный раствор в виде двух составляющих растворов с заданными значениями рК, каждый раствор вводят последовательно i Биопрепарат вводят в раствор между составляющими разделительного буферного раствора, рН составляющих разделительного буферного раствора и биопрепарат берут с заданным соотношением: pHjipHj pHj; рН р1о; lo-ipHj pIj} , рН, , рН - рН составляющих разделительного буферного раствора; рН - рН биопрепарата; р - величина изоточки вьщеляемого компонента биопрепарата; р1 - максимальная величина изоточки компонента из группы примесных компонентов биопрепарата со значением , меньшим рН,; р - минимальная величина изоэлектрической точки компонента из примесных фракций белкового препарата со значением, большим рН. 4 ил. с € СЛ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) Ai (SD 4 С 01 N 27/26 33 68

Г

lf

, » с

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТКРЫТИЙ (21) 3811410/28-14 (22) 29.10.84 (46) 15.03.87. Бюл, У 10 . (72) О.В.Митичкин, А,А,Лепский, C,А.Земляков и Л.P.Ñòoÿëîâà (53) 612.398 (088.8) (56) Гааль Э. и др. Электрофореэ в разделении биологических макромолекул.. М.: Мир, 1982, с. 153, (54) СПОСОБ ВЬШЕЛЕНИЯ БЕЛКОВОЙ ФРАКЦИИ (57) Изобретение относится к методам фракционирования веществ биологического происхождения и позволяет повы-! сить степень очистки целевого продукта. В злектрофоретической камере формируют разделительный буферный раствор в виде двух составляющих растворов с заданными значениями рН каждый раствор вводят последовательно. Биопрепарат вводят в раствор между составляющими разделительного буферного раствора, рН составляющих разделительного буферного раствора и биопрепарат берут с заданным соотношением: рН(рН срН; pH> = р1„;

)I арН pI ; pI > pH, > pI;> где рН,, рН вЂ” рН составляющих разделитель" ного буферного раствора; pH> — рН биопрепарата; pI - величина изоточки выделяемого компонента биопрепарата; pI< — максимальная величина иэоточки компонента из группы примесных компонентов биопрепарата со значением, меньшим рН,; pI< - минималь" ная величина изоэлектрической точки компонента иэ примесных фракций белкового препарата со значением, большим рН . 4 ил.

1296919 где pH<,рН рН, pI, pI, изоточки компонента

Изобретение относится к электромиграционным методам фракционирования веществ биологического происхождения и предназначено для очистки биологических веществ, в основном белков, электрофорезом в фармакологии, биохимии, молекулярной биологии, сельском хозяйстве и других областях.

Цель изобретения — повышение степени очистки целевого продукта путем формирования разделительно буферной смеси из буферных растворов с определенным соотношением значений рН, На фиг.1 показано распределение буферов в колонке до ввода биопрепарата; на фиг.2 — то же, после ввода биопрепарата; на фиг.З вЂ” процесс фореза при ориентации буфера с наименьшим рН к отрицательному полюсу, а с наибольшим рН к положительному; на фиг.4 — то же, с наименьшим рН к положительному полюсу, а с наибольшим рН к отрицательному, где .обозначено: HA — гемагглютинин;

ОА — овальбумин, Г1 — белок Г1; NA— нейтраминидаза; То -Т вЂ” различные моменты времени.

Способ осуществляется следующим образом.

В электрофоретической (рабочей) камере формируют разделительный буферный раствор в виде двух составляющих растворов с заданными значениями рН путем последовательного введения каждого раствора, Биопрепарат в растворе вводят между составляющими разделительного буферного раствора, при этом рН упомянутых составляющих разделительного буферного раствора и раствора биопрепарата берут с заданным соотношением рН,. рН, рН,; рн, = pIÄ

pI< pH pI<) pH< pI< рН составляющих разделительного буферного раствора; рН биопрепарата; величина изоточки выделяемого компонента биопрепарата; максимальная величина из группы примесных компонентов биопрепарата со значением, меньшим рН,;

2

pI — минимальная величина

2 изоточки компонента из группы примесных компонентов биопрепарата со значением, большим

pH .

При этом составляющие разделительного буферного раствора ориентируют соответственно с минимальным рН к отрицательному электроду, с максимальным рН вЂ” к положительному электроду °

После введения разделительных буферных растворов и раствора биопрепарата на колонку подается напряжение,- При этом на электрод со стороны буферного раствора с рН>рН (т,е, более щелочного или менее кислотного, чем рН раствора биопрепарата) подается положительный заряд, а на электрод со стороны буферного раствора с. рН<рН > (т.е. менее щелочного или более кислотного, чем рН раствора биопрепарата) подается отрицательный заряд, В этом случае находящийся в изоэлектрической точке компонент биопрепарата не имеет заряда и его частицы,,соответственно, не подвергаются электрофорезу. Примесные компоненты, частицы которых имеют положительный или отрицательный заряд, начинают двигаться к электродам противоположного знака и попадают в среду с рН, которая вызывает еще более сильную диссоциацию их, т,е, увеличение соответствующего заряда, что приводит к ускорению движения от места в сторону соответствующего электрода. B результате в месте ввода остается только выделяемый компонент биопрепарата, а все примесные компоненты, частицы которых имеют положительный или отрицательный заряд, удаляются в разделительные буферные растворы, Отбор заданной фракции производится из зоны ввода биопрепарата, Пример 1. Выделение гемагглютинина вируса гриппа Х/Ленинград/54 из обогащенного дезинтеграта, содержащего помимо гемагглютинина также белковые примеси (овальбумин, гликопротеид-белок И и нейтраминидазу), Известные значения изоэлектрических точек этих белков составляют: гемагглютинина рТ„ = 5,8, овальбумина

pI, = 4,5, белка M pI, = 5 0 нейтраминидазы рI 7,5. Готовят буферные растворы (например, трис-боратные) со следующими значениями рН: буфер

3 12 с рН 5,5, т,е. со значением меньшим, I Ц чем рЕ,, но большим, чем рЕ и рЕ, 1 ч тобы приме сные б елки э вальбумин и белок М имели подвижность, но не достигли изоточек (pI >рН, ) pI, ); буфер с рН 7,0, т.е. со значением большим, чем pI, но меньшим, чем pI, чтобы примесь нейтраминидазы имела подвижность, но не достигла изоточки (рЕ,< рН,.рЕ,) .

Буфер с рН1 заправляется в нижнюю половину камеры разделения колонки.

Затем верхняя половина камеры разделения заполняется буфером с рН .

Раствор исходного белкового препарата с гемагглютинином титруется, например, трис-боратом до величины рН, равной значению иэоточки гемагглютинина (т.е. рН = рЕ = 5,8). После чего раствор с рН с препаратов вводится в камеру разделения в зону между буферами рН< и рН, Затем на колонку подается напряж ние постоянного тока. Молекулы всех белков в растворе приобретают поверхностный заряд, однако знак заряда (положительный или отрицательный) за счет амфотерных свойств белков может быть тот или иной в зависимости от того, больше или меньше рН среды относительно значения иэоточки, а величина заряда тем больше, нем больше разница между значениями изоточки pI данного белка и рН среды, В приведенном выше примере в исходной зоне введенного белкового препарата с рН заряд гемагглютинина равен нулю (так как pH> = pIO), овальбумин и белок М заряжаются отрицателы о (так

I как pH>vpI, и pI ), а нейтраминидаэа — положительно (так как pH>

Тйким образом, для удаления из зоны неподвижного гемагглютинина сопутствующих белковых примесей, иэоточки которых имеют значения больше и меньше, чем у очищаемого белка, при формировании разделительной буферной системы в колонке составляющие этой системы взяты в соотношении рН, рНз<рН . При невыполнении этого соотношения не обеспечиваются условия неподвижности очищаемого в зоне ввода препарата при безостановочном движении всех примесных белков.

При ориентации более кислого буфера рН< к отрицательному электроду, а более щелочного рН к положительному нейраминидаза двигается к от96919 4 нина замедляется, а скорость движения белка М, имеющего значение изоточки

1I

4 рЕ, очень близкое к изоточке pIO

У гемагглютинина (равный рН ), незначительна, в данном примере соизмерима с диффузионным движением (размыканием) границ зоны рН> в сто1 роны буферных растворов. При этом ввиду близости значений изоточек выделяемого белка и примесных белков в данном примере при обратной полярности электродов относительно буфе- . ров (т.е, при ориентации рН к плюсу, а рН к минусу) снижается степень очистки белка гемагглютинина и увеличивается время процесса.

Пример 2. Выделение сывороточного альбумина человека из белко50 вой смеси, содержащей патологические функции алюбумина и гемоглобина. Значения изоэлектрических точек этих белков составляют: нормального сь вороточного альбумина (очищаемого)

pIä = 5,3, патологически измененных изомеров альбумина в диапазоне pI<

4, 0-4, 1, иэомеров гемоглобина в диапазоне рЕ = 7,0-7,3.

55 рицательному полюсу, а овальбумин и белок M — к положительному. Гемагглютинин .остается неподвижным. На границах зоны pH> ° с буферами рН, и рН2 происходит скачкообразное увеличение электрофоретических подвижностей примесных белков нейраминидазы, овальбумина и белка М, которые удаляются с повышенной скоростью от зоны ге10 магглютинина и собираются на концах камеры разделения, После окончания процесса фореза производится отбор зоны рН, которая содержит очищенный гемагглютинин.

В приведенном примере при обратной полярности электродов относительно буферов, т.е. при ориентации минимальным рН к положительному электроду, а максимальным рН к от20 рицательному — миграция примесных белков овальбумина, белка М и нейра.минидаэы происходит в обратных направлениях. Гемагглютинин остается неподвижен . Однако на границах зоны рНу с буферами рН и рН происходит скачкообразное уменьшение зарядов примесных белков и, соответственно, скачкообразное уменьшение их электрофоретических подвижностей и удаление этих белков от эоны гемагглюти5 12969

Готовят буферные растворы (например, трис-боратнополимерное) со связующими значениями рН: буфер с рН, 4,8 (из условия, что и в примере 1 рХр pH,> pI, ); буфер с рН 6,0 (также, как в примере 1, из условия pI «, +pHz«pIz)

Буфер с рН< заправляется в нижнюю половину колонки, с рН вЂ” в верхнюю половину, а раствор биопрепарата, от- 1О титрованный (например, трис-боратом) до рН pIp = 5,3, вводится в колон ку между буферами рН, и рН, Затем на электроды колонки подается напряжение, В данном примере нормальный альбумин не имеет заряда и остается неподвижным в зоне ввода (так как рН = р? ). Патологические изомеры альбумина заряжаются отрицательно (так как рН +pI ), а изомеры гемоглоСи><а положительно (так как рН,рТ,).

Таким .образом, для обеспечения условий неподвижности очищаемого белка в зоне ввода, при непрерывном уда25 лении от него нежелательных примесей, составляющие буферной системы взяты в соотношениях

pH «.рН рН

При ориентации более кислого буфера рН, к отрицательному полюсу, а более щелочного рН к положительному гемоглобин двигается к минусу, а па- 35 тологические иэомеры альбумина — к плюсу. Но на границах зоны рH> с буферами рН< и рН электрофоретические.подвижности всех примесных белков скачкообразно возрастают, соответственно, и скорости удаления от зоны ввода. Примесные белки собираются на концах камеры разделения, после чего производится отбор эоны рН, содержащей иормальный очищенный альбумин, В приь<ере 2 при изменении полярности электродов относительно буферов рН> и:рН (т,е, при ориентации рН,- к плюсу, а рН к минусу) миграция 50 примесных .белков происходит в обратных направлЕниях, но нормальный альбумин остается неподвижен"(так как его заряд равен нулю при рН = pIp).

При этом на границах зоны рН> с буферами рН> и рН ввиду уменьшения зарядов примесных белков (так как значения рН растворов ближе к их

pI)< происходит скачкообразное умень19 6 шение их подвижностей. Однако ввиду того, что значения изоточек примесей далеки от значения pIp очищаемого белка, существенного снижения скоростей движения примесных белков не происходит, а лишь удлиняется время процесса беэ заметной потери качества отбираемой фракции нормального альбумина, Пример 3. Выделение гемагглю тинина вируса гриппа штамма А2/Ленинград/385 из дезинтеграта гельфильтрационной очистки, содержащего помимо гемагглютинина А2 также белковые примеси: овальбумин, гликопротеид— белок М, нейраминидаэу А2 и алантоисный гликопротеид. Значения изоточек этих белков составляют; гемагглютинина A2 pIp = 7,1, овальбумина

1 II

pI, = 4,5, белка M pI = 5,0, нейраI минидазы А2 pIz = 8,0, алантоисного

П гликопротеида pIz = 8,5.

Готовят буферные растворы (например, трис-боратглицериновые) со следующими значениями рН: буфер с рН>

6,8 (из условия, что и в примере 1

pI >pH„>pI<); буфер с рН 7,3 (как и в примере 1 из условия рГ «рН «р? )

Буфер с рН, заправляется в нижнюю половину колонки, с рН вЂ” в верхнюю половину, а раствор биопрепарата, оттитрованный (например, трис-боратом) до pH> = pIp = 7,1, вводится между буферами рН, и рН . Затем на электроды колонки подается напряжение, В данном примере гемагглютинин А2 не заряжен и остается неподвижен в зоне ввода (так как pH> =- pIp), овальбумин и белок М заряжаются отрицательl !> но (так как рН )рХ> и pI„), а нейраминидаза А2 и алантоисный гликопротеид — положительно (так как рН «р?

И г и pIz ) ò

Таким образом, для обеспечения условий, при которых выделяемый белок останется неподвижным, в стартовой зоне, а примесные белки различногб заряда имеют электрофоретическую подвижность на всем пути миграции их от стартовой эоны до полюсов, составляющие буферной системы взяты в соотношениях рН<«.ðÍ «pH . При ориентации минимальным рН< к отрицательному электроду, а максимальным рН к положительному движению при2 месных белков: овальбумина и белка М вЂ . происходит к плюсу, а нейраминидазы А2 и алантоисного гликопро.7 12969 теида — к минусу. Гемагглютинин А2 остается на месте. При миграции примесных белков из зоны ввода на границах зоны рН> с буферами рН и рН подвижности этих белков скачкообразно возрастают. В ходе процесса примесные белки с повышенной скоростью отходят к концам камеры разделения.

По окончании процесса фореза производится отбор зоны рН> содержащий !О очищенный гемагглютинин А2.

В примере 3 при изменении полярности электродов относительно буферов рН< и рН (т,е. при ориентации рН, к плюсу, а рН к минусу) 15 миграция белков примесей происходит в обратных направлениях, гемагглю- тинин А2 по прежнему остается на месте ввода (так как его заряд равен нулю при pH = pI0). Однако при миг- 20 рации примесей из зоны ввода рН> на границах зоны рН > с буферами рН, и рН происходит скачкообразное умень-. шение их подвижностей. При этом замедляется движение овальбумина, белка

М, алантоисного гликопротеида, а нейраминидаза А2 имеет незначительную подвижность (ввиду близкости ее изоточки с величиной изоточки pI ). В результате по сравнению с первоначальной полярностью электродов процесс очистки от овальбумина, белка M и алантоисного гликопротеида происходит, но медленнее, а качество очистки от нейрамйнидазы А2 ухудшено вви- 35 ду того, что скорость ее движения оказывается соизмеримой с диффузионным движением (размыванием границ зоны рН> в стороны буферных растворов). В данном случае этого примера по окончании процесса из зоны ввода отбирается гемагглютинин А2, который хорошо очищен от примесных белков овальбумина, белка M и алантоисного гликопротеида, но значительно хуже очищен (чем при ориентации рН к минусу, а рН к плюсу) от нейраминидазы А2. Однако, поскольку для практических целей присутствие гемагглюформула изобретения

Способ выделения белковой фракции путем введения белкового препарата между буферными растворами разделительной буферной смеси, состоящей из нескольких буферных растворов, с последующим электрофорезом, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта, при формировании разделительной буферной смеси рН составляющих ее буферов устанавливают в соответствии со следующими соотношениями рН рН рН, рНэ = pIo

pI c»H Р ь pIO> РН Р, величины рН составляющих разделительной буферной смеси; величина рН раствора белкового препарата; величина изоэлектрической точки компонента выделяемой фракции белкового препарата; максимальная величина изоэлектрической точки компонента из примесных фракций белкового препарата со значением, меньшим рН, минимальная величина изоэлектрической точки компонента из примесных фракций биопрепарата со значением, большим рН где рН,, рН рН

pI

pI

19 .8 нитина совместно с нейраминидазой яв,ляется безвредным или дазе желательным (например, для создания молеку1 лярных вакцин и антисывороток), данный вариант ориентации полярности электродов и буферов в примере 3 является допустимым, 1296919

ОА

НЯ

HA

0m

0ЧИЩРННЯ20 ВЕщже

Юа

NA (O gO bO 1О рН

Фиг. Z

Истер

piYg c(cggf по Adюнги а&м дж дУЯВЮинион дМIТ4

am ируса ,Рипа) 1296919

1 иьин аъ

Со ставит ель Н, Гуля ева

Техред И.Попович

Корректор Г Решетник

Редактор Н.Киштулинец

Подписное

Тираж 777

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4I5

Заказ 769/45

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул. Проектная, 4