Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ , используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биолот ии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus,.продуцирующих моноклональные .антитела (МкАТ) к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека (АПФ).Штамм A-ACE-5F1 получают гибридизацией иммуннь1х клеток селезенки мышей BAIjB/ /с с клетками миеломы X63-Ag8-653. Он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)27Д. Клетки штамма культивируют на среде RPM1-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, кратность рассева 1:10 - 1 раз в 3-4 дня. При введении 2-5-10 клеток в брюшную полость мышей BALB/C асцит образуется через 12-16 дн. Продукция МкАТ составляет 45-55 мкг/мл культуральной жидкости и 6-8 мкг/мп асцитической. МкАТ относятся к классу JgGj.. Они специфически взаимодействуют с определенным эпитопом молекулы АПФ и используются для выявления его на срезах тканей, мембране клеток,биологических жидкостях и т.д. 2 табл. (О СЛ I о 00 Oi N3 СП

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО@4АЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

{58 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A BTOPGHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3996728/28- 13 (22) 25. 12.85 (46) 07.05.87. Бюл. ¹ 17 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (72) Е.Ю.Алликметс, С.M.Данилов, И.Ю.Сахаров, Е.А.Духонина, И.Н.Трахт и В.Н ° Смирнов (53) 578.085.23(088.8) (56) Auerbach R. etc. all. Proc. Natl.

Acad. Sci USA, 1982, 79, рр. 78917895. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК МЫШИ MUS MUSCULUS,ÈÑÏÎËÜÇÓÅМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМУ

ФЕРМЕНТУ ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus,- продуцирующих моноклональные,антитела

„Л0„, 1308 25 А1 (МкАТ) к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека (АПФ).Штамм

A-АСЕ-571 получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мьппей BALÂ/

/с с клетками миеломы Х63-Ая8-653.

Он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитоло— гии АН СССР под номером ВСКК(П)27Д.

Клетки штамма культивируют на среде

RPM1-1640 с добавлением 107 эмбриональной телячьей сыворотки и 107. лошадиной сыворотки, кратность рассева 1:10 — 1 раз в 3-4 дня. При введении 2-5 10 клеток в брюшную полость мышей BALÂ/с асцит образует- ф ся через 12-16 дн. Продукция МкАТ составляет 45-55 мкг/мл культуральной жидкости и 6-8 мкг/мл асцитической. МкАТ относятся к классу QGj

Они специфически взаимодействуют с определенным эпитопом молекулы АПФ и используются для выявления его на в ! . срезах тканей, мембране клеток,биологических жидкостях и т.д. 2 табл.! t3O

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Мггв пывси1ггв, используемый для получения моноклональных антител (МкАТ) к определенному эпитопу ангиотензин-превращающего фермента легких человека (АПФ).

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/ñ иммунизируют внутрибрюшным введением 80 мкг ангиотензин-превращающего фермента, выдеденного из ткани легких человека, в

0,2 мп забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащем 307 полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дн иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно 60 мкг антигена в ЗФР без адъюванта. Через неделю мышам вводят

60 мкг фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Чере три дн после этого 15х х 10 клеток селезенки иммунных мышей гибридизуют с 5х10 клеток миеломы мыши Х63-А 8-653 в присутствии 0,7мл раствора, содержащего 457 (объем/

/объем) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. мас. 3350 и 15% диметилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2х х 10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPM1-1640 с добавлением 107 лошадиной и 107 телячьей эмбриональной сыворотки, 10 M гипоксантина, 4x10 M аминонтерина и 1,бх10 M тимидина.Гибриды-продуценты клонируют два раза методом конечных разведений, высевая по одной клетке в лунку,содержащую 4х104 клеток селезенки.

После 2-ro клонирования практически

1007 сублонов продуцируют антитела к ангиотензин-превращающему ферменту.

Продуктивные клоны обозначают

А-ACE-5F1.

Штамм А-АСЕ-5F1 хранится в специа лизированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 27 Р и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда RPM1 †16 с добавлением 107 эмбриональной теля8625 2 чьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 m M L- лютамина, 10 m М пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина,100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот для базальной среды Игла,ви— таминов для среды Игла и 0,05 гп М меркаптоэтанола.

Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 57. СО . Посевная доза

100 тыс. клеток/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дн, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная.

Для выращивания гибридомы в организме животных клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/с в количестве

2-5-10 клеток. на мышь. Асцит образу, ется через 12 — 16 дн, Штаммы в организме животных не перевивали.

20 Продуктивность штамма. Продукция моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 45-55 мкг/мл культуральной жидкости и 6-8 мкг/мл асцитической жидкости. Продукция антител в культуре сохраняется гга протяжении восьми пассжей.

Характеристика моноклональных антител. Антитела относятся к классу

IpGj .Они специфически взаимодейству1 ют с определенным эпитопомАПФ.Специ— фичность взаимодействия определяется с помощью твердофазного иммунофер-. ментного метода (ELISA) и теста на

"обогащение".

35 Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды„ Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и ткмидиновой метке культуральной среды.

Криоконсервирование. 1-5 10 клеь ток штамма консервируют в 1 мл те45 льячей эмбриональной сыворотки с добавлением 107. диметилсульфоксида .в пластиковых . ампулах. Замораживание проводят в программном замораживателе по следующей программе: о температуру снижают по 4 С в 1 мин до 4 С и по 1 С в i мин до — 40 С.

Клетки хранят в жидком азоте.РазмоС раживание: быстро при 37 С. Жизнеспособность после размораживания составляет 70-807.

Пример 1. Гибридные клетки помещают B пластиковый флакон площадью 25 см по 5х10 в 5 мл среды

RPM1 †16 с 107. эмбрионалг,ной Tp IB25

Результаты опыта по изучению специфичности связывания иммуногло- Культуральная среда булинов.из культуральной среды штам- 45 ма А-АСЕ-5FI с АПФ легких человека э сорбированном на пластике, представлены в табл. 1 (приведенные данные— среднее из трех независимых значениф

ОптичесРазведение кая плотность при

490 нм

3 13086 чьей сыворотки. 107. лошадиной сыворотки, 4 m M глютамина, 10 m M пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 m M меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3-4 дн при 37 С в атмосфере, содержащей 57 СО . Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение

10 мин при 800 g n 4 С. Полученный супернатант используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антитела с ангиотензинпревращающим ферментом легких человека с помощью ELISA-метода.

На полистироловую 96-ячеечную 15 панель для микротитрования сорбируют

АПФ-1 в 50 мкл карбонатного буфера (100 ш М рН 9,6) при 4 С в течение, ночи. После насыщения панели отмывают 0,27.-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком в ячейки панели вносят 50 мкл культуральной среды штамма А-АСЕ-5Г1 (на 1 ч при 37 С).

После этого панель отмывают четыре раза по 100 мкл ЗФР с 0,27;ным раствором БСА и 0,057.-ным раствором

"Твин-20" и вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мы- 30 ши, ковалентно связанных с пероксидазой (на 1 ч при 37 С). После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают укаэанным способом, а связавшуюся пероксида- 35 эу, а значит, и айтитела против АПФ определяют количественно по расщеплению субстрата (Н О ) в присутствии. хромогена-ортофенилендиамина.Положительная реакция проявляется коричне- 40 вым окрашиванием и просчитывается при 490 нм. на ячейку в концентрации 20 мкг/мл (при 4 С на ночь), затем после забивки плашки 0,27-ным раствором БСА в ЗФР для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной среды от клеток штамма

А-АСЕ-5FI, полученной по примеру 1.

После отмывки панели 0,27.-ным раствором БСА в ЗФР от несвязавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор

АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкг/мл). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом А-АСŠ— 5FI, определяют количественно в ячейках для микротитрования с помощью флуоресцентного метода, используя в качестве субстрата Hip-His-Leu.

Результаты опыта по изучению спе— цифичности взаимодействия МкАТ, вырабатываемых клетками штамма Л-АСЕ—

5F1 с АПФ в растворе, приведены в табл. 2.

Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител, вырабатываемых клетками штамма А-АСЕ-5FI по отношению к АПФ, и показывают возможность их применения для выявления

АРФ в растворах (биологических жидкостях, экстрактах Тканей и т.д.).

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus ВСКК(П) к- 27 D (специализированная коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР), используемый для получения моноклональных антител к ангиотенэин- превращающему ферменту легких человека.

Таблица!

1 0,78

Штамм А-АСЕ 5FI

1:10 0,72

1:100 0,54

I 1000 О 13

Результаты представленные в табл. 1, свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител, вырабатываемых клетками штамма

А-АСЕ-5FI.

Пример 2. На полистироловую

96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши : 100 мкл

1308625

Продолжение табл.2

Продолжение табл.1

2 3 Культурная ср

0,08

1: 100 0,64

1: 1000 0,44

0,330

0,340

1:10

Таблица 2

Разведение

Культуральная среда плазмы человека, 0,2Х-ный раствор

БСА в ЗФР

0,324

1,43

1,07

Штамм А-АСЕ-5FI 1

1:10

Составитель N.Ñåðîâà

Редактор А.Козориз Техред Л.Сердюкова Корректор С.Шекмар

Заказ 1774/21 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Штамм "8G4", выраба- 1 тывающий МкАТ против липопротеидов 1:10 0,07 низкой плотности из плазмы человека 1

0,27. — ный раствор БСА в ЗФР+

Если вместо АПФ в ячейке сорбирован БСА, то количество иммуноглобулинов из штамма А-АСЕ-5F1, сорбированных.на БСА и выявляемых методом

ЕЫЯА, находится на уровне негативного контроля.

Актив.ность +

АПФ в ячейке (флуор. отн.ед.) Штамм "8G4", вырабатывающий антитела против липопротеидов низкой плотности из

25 +

Среднее из трех независимых опре,делений.