Способ выявления нейронов при люминесцентной микроскопии

 

Изобретение относится к гистологии . Для Уменьшения диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур в мозг вводят раствор пероксидазы хрена и краситель , содержащий, мас.%: прта1улин 5-10, диметилсульфоксид 1,5-2 и вода - остальное. Готовят гистологические препараты. Срезы промывают в изотоническом фосфатном буфере рН 7-7,2 в течение 20-30 мин. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) m) 4 С 01 N 1/28

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

М А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3861972/28-14 (22) 27.02.85 (46) 23.06.87. Бюл. № 23 (71) Институт физиологии им. А.А.Богомольца (72) В.А.Майский, С.Д.Кузовкова и Н.З.Дорошенко (53) 616-0.88.8(088.8) (56) Yezierski R.P. et al., А retro—

grade label tracing technique using

horseradish pегоxidase and the fluorescent. — I.Neurosei, Methods, 1981, v. 4, № 1, р. 53-62.

Авторское свидетельство СССР № 1104376, кл. С 01 N 1/28, 1984. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕЙРОНОВ ПРИ

ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ (57) Изобретение относится к гистологии. Для уменьшения диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур в мозг вводят раствор пероксидазы хрена и краситель, содержащий, мас.Е: примулин

5-10, диметилсульфоксид 1,5-2 и во— да — остальное. Готовят гистологические препараты. Срезы промывают в изотоническом фосфатном буфере рН 7-7,2 в течение 20-30 мин. 2 табл.

18839

ЗО

1 13

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может быть использовано при изучении организации нервных центров и характера дивергенции аксонных коллатералей в головном и спинном мозге, а также при изучении проводящих путей в периферической нервной системе.

Цель изобретения — уменьшение диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур мозга благодаря использованию примулина с добавкой диметилсульфоксида, обеспечивающих высокую степень связывания с белками цитоплазмы.

Пример 1. Животному (белая крыса) производят микроинъекцию в мозг (в разные отделы хвостового ядра) 1 мкл 30%-ного водного раствора пероксидазы хрена и 1 мкл 10 -ного водного раствора примулина с добавлением 2 .,циметилсульфоксида. Через два дня животное перфузируют фиксатором — раствором параформальдегида и из фиксированной ткани мозга изготавливают на замораживающем микротоме срезы толщиной 30 мкм. Производится гистохимическая окраска срезов (известным способом). Срезы промывают

30 мин в холодном фосфатном буфере (0,1 11; рН 7,2) с добавлением 10 сахарозы, натягивают на предметные стекла и высушивают, а затем обезвоживают в спиртах, просветляют в толуоле и заключают в нелюминесцирующую среду (эпон 812) ° Наблюдение окрашенных примулином и пероксидазой хрена нейронов производится в обычном свете и свете люминесценции при длине волны возбуждающего света 300450 нм. Двухцветное свечение клетоктемно-синее и золотистое — указывает на двоййое их окрашивание флюорохромом лл ферментом.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, однако концентрация примулина в инъецируемом растворе меняется. Интенсивная аккумуляция красителя в нейронах наблюдается при концентрации его в инъецируемом растворе 5-10 . При увеличении концентрации красителя увеличивается и интенсивность его аккумуляции в нейронах. 10 -ный водный раствор примулина является наиболее оптимальным, однако такой раствор является уже насыщенным для данного красителя. Снижение концентрации примулина (менее 5%) приводит к уменьшению свечения меченных флюорохромом клеток.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру i за исключением концентрации диметилсульфоксида (детергента) в инъецируемом растворе примулина. Более эффективный захват красителя в зоне микроинъекции и его ретроградный аксонный транспорт наблюдается при концентрации диметилсульфоксида 1,5-2 . Увеличение концентрации диметилсульфоксида (более

2 ) приводит к деструктивным изменениям ткани в зоне микроинъекции, а уменьшение его концентрации (менее

1,5 ) снижает его эффективность как детергента. Оптимальное значение концентрации диметилсульфоксида состав-. ляет 1,8 .

Зависимость интенсивности флюоресценции окрашенных примулином нейронов от его концентрации и концентрации детергента (диметилсульфоксида) в инъецируемом растворе приведена в табл. 1 °

Пример 4. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением длительности промывания срезов. Промывание срезов в холодном иэотоническом фосфатном буфере восстанавливает частично погашенную люминесценцию клеток после гистохимической окраски. Длительность промывания составляет 2030 мин, оптимальное время 25 мин.

При сокращении этого времени (менее

20 мин) не наблюдается полного восстановления свечения окрашенных примулином клеток, а при удлинении проMbIBBHIDI (более 30 мин) происходит вымывание красителя из клеток, что снижает интенсивность их флюоресценции.

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением изменения кислотности фосфатного буфера. 1(ислотность среды является важным параметром для восстановления свечения окрашенных примулином клеток. Лучшее восстановление свечения достигнуто при кислотности изотонического фосфатного буфера 7,0-7,,2. Оптимальное значение кислотности среды при рН

7,1. Уменьшение кислотности буфера (рН больше 7,2) приводит к неполному восстановлению свечения, а увеличение кислотности буфера (рН меньше 7,0) вызывает изменение спектра эмиссии люминесцирующих клеток.

20

Таблица1

Концентрация Интенсивность Концентрация Интенсивность примулина, % флюоресценции детергента, % флюоресценции

О,!

0,1

0 5

5,2

20

50

1,3

95,5

1,5

98,5

100

97,4

1,8

97,5

99,5

55

100

100

П р и м е ч а н и е. 3а исходный уровень (100%) флюоресценции берут интенсивность свечения примулина в срезах мозга в случае использования насыщенного раствора фпюорохрома и

1,8% детергента.

Зависимость уровня восстановления флюоресценции окрашенных примулином нейронов от времени отмывания приведена в табл. 2.

Оптимальные значения указанных параметров (концентрация красителя и диметилсульфоксида, время отмывания, кислотность буфера) получены в опытах на 170 крысах и 10 кошках.

Предлагаемый способ по сравнению с известными способами обладает большей чувствительностью и точностью, так как в качестве одного из красителей используется водный раствор примулина с диметилсульфоксидом. Примесь диметилсульфоксида превращает примулин в транспортно-специфический краситель, длительное время удерживаемый в цитоплазме меченых клеток in vivo и in vitro. Примулин способен к прочному связыванию с белками цитоплазмы меченного им нейрона при отсутствии диффузии красителя из клетки. Примулин обладает высоким квантовым вы18839 4 ходом, устойчив при ультрафиолетовом облучении. формула изобретения

Способ выявления нейронов при люминесцентной микроскопии путем микроинъекции красителя в мозг с последующим введением пероксидазы хрена !

О и приготовлением гистологического препарата, отличающийся тем, что, с целью уменьшения диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур мозга, !

5 в качестве красителя используют состав, содержащий примулин и диметилсульфоксид при следующих соотношениях компонентов, мас.%:

Примулин 5-10

Диметилсульфоксид 1,5-2,0

Вода Остальное далее после введения пероксидазы хрена мозг промывают в изотоническом фосфатном буфере рН 7,0-7,2 в течение 20-30 мин °

1318839

Таблица 2

Время отмывания, мин

Восстановление флюоресценции, %, рН 7 1

Восстановление флюоресценции, 7, за

25 мин отмывания рН

0 5

3,3

5,=

4,0

10,1

65,3

5 0

22,0

98,5

6,0

60,3

100

7,0

100

100

7,1

100

100

7,2

100

98,9

94,5

7э3

7,5

60

8,0

20,5

П р и м е ч а н и е. За исходный уровень (100X) флюоресценции клеток берут интенсивность свечения флюорохрома (примулина) в фиксированных в формалине и не подвергнутых гистохимической окраске срезах мозга.

Составитель Л. Соловьев

Техред А.Кравчук Корректор А.Обручар

Редактор Н.Тупица

Заказ 2500/34

Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4