Способ диагностики эхинококкоза
Изобретение предназначено для биохимии при диагностике эхинококкоза. Цель изобретения - повьшение чувствительности способа путем использования в качестве меток антигена фермента каталазы с ферментативной активностью 30-1000 нкат и про,- стого по составу субстрата (Н.О,, в концентрации 0,001-0,0005%, KI 1-5% и крахмал 0,1-0,2%). Результат анализа проявляется через 20-30 мин в виде синего окрашивания в лунках, где отсутствуют антитела к эхинококновому антигену. При наличии антитела к эхинококковому антигену окрашивания нет. 4 табл. СП
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„Я0„„13322 (511 4 G 01 N 33/535
ВСРУ 1:. . а
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3887313/28-14 (22) 17.04. 85 (46) 23,08.87, Бюл, У 31 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней (72) В.А.Шамардин, Ю,А,Кузьмин, Б,В,Каральник, П,П,Гладышев и Ю,А,Шаповалов (53) 615.373 (088.8) (56) Курманова Л,В. Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней, M. 1980, с, 24-31, (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭХИНОКОККОЗА (57) Изобретение предназначено для биохимии при диагностике эхинококкоза. Цель изобретения — повышение чувствительности способа путем использования в качестве меток антигена фермента каталазы с ферментативной активностью 30-1000 нкат и простого по составу субстрата (Н О в концентрации 0,001-0,0005K, KI 1-5Х и крахмал 0,1-0,2X). Результат анализа проявляется через 20-30 мин в виде синего окрашивания в лунках, где отсутствуют антитела к эхинококковому антигену, При наличии антитела к эхинококковому антигену окрашивания нет, 4 табл.
13322
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для диагностики эхинококкоза, Целью изобретения является повы5 шение чувствительности способа за счет использования в качестве меток антигена фермента каталазы, Пример 1, Определение антител в сыворотке больного эхинокок- 10 козом. Адсорбцией эхинококковый антиген фиксируют на поверхности лунок планшет. Затем вносят в лунки по
О,1 мл исследуемой сыворотки человека с разведения 1:50 и после экспо- 15 зии и отмывания избытка сыворотки вносят по 0,1 мп коньюгата с активностью фермента 100 нкат (вносимый в лунки коньюгат состоит из прочного комплекса глобулинов кроличьей 20 антисыворотки против глобулинов сыворотки человека и фермента каталазы, сшитых глютаровым альдегидом), выдерживают 60 мин при 37 С и отмывают 0,05%-ным раствором твина-20, Пос- 25 ле этого во все лунки добавляют
0,05 мл Н О и выдерживают в течение
30 мин, затем в эти же лунки вносят
0,025 мл 5 -ного раствора KI u
0,025 мл 0,1 .-ного раствора крахмала, 30
Результат, анализа проявляется через
20-30 мин в виде синего окрашивания в лунках, где отсутствовали антитела к эхинококковому антигену. В случае, если исследуемая сыворотка в определенных разведениях содержит антитела к эхинококковому антигену, соответствующие лунки остаются бесцветными, Влияние ферментативной активности каталазы в используемом для реакции коньюгате показано в табл.l
Таким образом, коньюгат работает специфически с ферментативной активностью 1000 нкат, При активности менее 30 нкат он не дает положительной 45 реакции с иммунной сывороткой, Слезз 2 довательно, коньюгат может применяться с ферментативной активностью 30- "
1000 нкат.
Влияние концентрации Н 0 и KI
2 2 на чувствительность реакции показано в табл.2.
Из приведенных в табл.2 результатов видно, что оптимальным сочетанием для проявления активности каталаэы являются концентрации Н О 0„00100 0005 и KI lâ0 5i0
Влияние дозы крахмала на чувствительность метода показано в табл,3, Из результатов, приведенных в табл,з видно, что оптимальной концентрацией крахмала является 0,1.—
0,2%-ный раствор, Чувствительность диагностики при использовании коньюгата с пероксидазой (известный метод) и каталазой (предлагаемый метод) показана в табл.4.
Таким образом, предлагаемый способ, основанный на использовании фермента каталазы и простого по составу субстрата, позволяет с большей чувствительностью проводить определение антител по сравнению с известным способом.
Формула изобретения
Способ диагностики эхинококкоза, включающий фиксацию антигена на твердой фазе, добавление исследуемой сыворотки крови вторичного коньюгата антигена с ферментом и соответствующего субстрата, о т л и ч а ю— шийся тем„ что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве фермента для коньюгата используют каталазу с активностью 301000 нхат и добавляют субстрат, содержащий Н О в концентрации 0,001— ,0„0005, KI 1-5 и крахмал 0,1-0,2, 1332233
Таблиц а 1
1:10
1!3000 1:1000 1:300
1:100 1:30
Иммунной
1:10
1:50
1:250
+ + +, Нормальной
1:10
1:50
1:250
П р и м е ч а н и е, + — положительный результат реакции;
tt 1! — отрицательный результат реакции, Таблиц а2
Разведение Разведение иммунной сыворотки, дающее положиKI Ж тельный результат, при концентрации Н О, X
1:80 1:160 1:160 Реакция
1:40
0,5 отрицательная
1:160 1:200 1:320 1:320
1,0
1:160 1:200 1:320
1:320
5,0
1: 160 1: 200 1:320 1: 320
10,0 к+ к+
П р и м е ч а н и е, к+ — положительная реакция в контроле, Разведение сыворотки
Результат реакции при активности каталазы, .нкат, в коньюгате
Без разведения
Без разве- 0,1 0,01 0,001 0,0005 0,00025 дения
Реакция отрицательная
1332233
Таблица3
Разведение сывороток больных, дающих положительный результат
Концентрация крахмала, %
Бальной М, Больной С, Больной А, Больная Д, Больная С. (1: 20
0,8
c 1: 20 (1:-20 0,4 1:60 1:40 1:100 1:40 1:30 0,2 1:120 1:80 l: 120 0,1 1: 120 1:80 ): 120 Реакция отрицательная 0,05 Реакция Реакция Реакция Реакция отрицатель- отрицатель- отрицатель-отрицательная ная ная ная Таблица4 Разведение сывороток больных эхинококкозом с положительным результатом реакции Используемый коньюгат Больной А, Больной С, Больной Д, Больная В. Больная <1: 50 1:1600 l: 800 ):400 1:200 1:800 (I 50 1:3200 1:2400 1:560 1:800 1:1600 Составитель М, Васильев Редактор А, Ворович Техред А . Кравчук Корректор А,Обручар Заказ 3826/40 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, r, Ужгород, ул. Проектная, 4 С пероксидазой (известный) С каталазой (предлarаемый) I:160 1:160 ? ! 1:240 1:240 ыворотка дорового еловека
