Способ определения антигенов и антител

 

Изобретение относится к иммунологии и предназначено для одновременного определения 2-х антигенов . в одном опыте иммуноферментного анализа. Цель изобретения - увеличение числа определяемых в одной пробе антигенов или антител за счет использования 2-х коньюгатсв с различными ферментами. Для этого на полистироловую твердую фазу адсорбируют антиген (Аг) или антитела (Ат), инкубируют с исследуемой пробой, со-, держащей Аг или Ат, затем вносят смесь специфических коньюгатов соответственно Аг или Ат со щелочной фос фатазой и пероксидазой, далее вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы, колориметрически определяют концентрацию одного Аг или Ат, затем твердую .фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы, по оптической плотности которого определяют концентрацию второго Аг или Ат. Таким образом, в одном опыте удается установить изотип синтезируемых антител и антигенов. 1 табл. с (Л

+

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!% (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3878181/28-14 (22) 04.04.85 (46) 23.02.87. Бюл Ф 7 (7 1) Институт иммунологии (72) N.Е.Иващенко, А.Л.Лиознер и P.M.Õàèòaâ (53) 6 15.373 (088 ° 8) (56) Vollev А. etal. Manual Clin..

Immuno1. Virol, 1976, v.69, рр. 506-512. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

И АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к иммунологии и предназначено для одновременного определения 2-х антигенов: в одном опыте иммуноферментного анализа. Цель изобретения — увеличение числа определяемых в одной пробе антигенов или антител за счет (50 4 А 61 К 39/00 С 01 N 33/535 использования 2-х коньюгатов с различными ферментами. Для этого на полистироловую твердую фазу адсорбируют антиген (Ar) или антитела (Ат), инкубируют с исследуемой пробой, со-, держащей Ar или Ат, затем вносят смесь специфических коньюгатов соответственно Аг или Ат со щелочной фосфатазой и пероксидазой, далее вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы, колориметрически определяют концентрацию одного Ar или Ат, затем твердую. фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы, по оптической плотности которого определяют концентрацию второго Ar или а

Ат. Таким образом, в одном опыте удается установить изотип синтезируемых антител и антигенов. 1 табл.

1291155

10

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для одновременного опеределения 2-х антигенов или 2-х антител в одном опыте иммуноферментного анализа.

Цель изобретения — увеличение числа определяемых в одной пробе антигенов или антител за счет использования 2-х конъюгатов с различными ферментами.

Способ осуществляется следующим образом.

На полистироловую твердую фазу (пробирки, микротитровальные плашки) адсорбируют антиген (Аг) или антитела (Ат), инкубируют с исследуемой пробой, содержащей Ат или Лг, затем вносят смесь специфических конъгогатов соответственно Аг или Ат со щелочной фосфатазой и пероксидаэой, делее вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы, колориметрических определяют поглощение проб и концентрацию одного Ат илн Аг, затем твердую фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы, по оптической плотности которого определяют концентрацию второго Ат или Аг.

Пример. Определяют иэотипическую и антигенную специфичности иммунного ответа 1п vitro с помощью разработанной тест-системы с двойной иммуноферментной меткой.

Объектом исследования служат супернатанты 5-дневных культур клеток селезенки мышей линии СВА, иммунизированных ггг чг. ко гаптеновой группировкой динитрофенилом (ДНФ), сорбированной на полистироле через неиммуногенный аминокислотный спейсер (алании или глицин). Тест-антигеном служит ДНФ-БГГ с эпитопной плотностью гаптена 30 на одну молекулу БГГ. В этих опытах двойная метка используется для выявления соотношения антител IgM/ IgG изотипов при первичном иммунном ответе на искусственный антиген.

Применение тест-системы с двойной иммуноферментной меткой для изучения иммунного ответа на гаптеновую группировку ДНФ in vitro приведено с таблице.

Постановка тест-систем с двойной иммуноферментной меткой включает приготовление иммуносорбентов. Антигенный сорбент готовят пассивной сорбцией ДНФ-БГГ на полистироле (10 мкг/мл конъюгата в PBS в течение

1S ч при 4 С); аффинный сорбент включает сорбцию белка А стафилококка в той же концентрации и в тех же условиях. Дополнительно незаполненные сайты полистирола "пассивируют"

1Х-ным раствором БСА, Все операции сопровождают промывкой панелей водопроводной водой и водой с 0,05ным Твин-20. .Вносят исследуемые культурные жидкостгг в объеме 50-100 мкл, инкубируют 45-60 мин, при 37.С, отмывают.

Вносят смеси конъюгатов (антиIgM — щелочная фосфатаза, антиIgG — пероксидаза или пероксидаза— анти — IgG — щелочная фосфатаза, в зависимости от задач опыта).

Постедовательно обрабатывают энзим-субстратами п — нитрофенилфосфатом и 5 — аминосалициловой кислотой с определением Соответственно уровня иммунных реагентов, связанных с соответствующим ферментом как визуально, так и спектрофотометрически.

Таким образом, в одном опыте удается установить изотип синтезируемых

1 антител, Формула изобретения

Способ определения антигенов и антител, включающий сорбицию антител или антигенов на твердой фазе, связанные ими соответствующих антигенов или антител из жидкой фазы, обработку полученных комплексов иммуноферментным конъюгатами с последующим определением количества антигена или антител по интенсивности окрашивания хромогенного субстрата, о т л и ч а ю щ и и с.я. тем, что, с цельго увеличения числа определяемых в одной пробе антигенов или антител, используют смесь специфических иммуноферментных конъюгатов антител или антигенон с пероксидаэой и щелочной фосфатаэой, при этом определение количества антигенов или антител осуществлягот путем последовательного внесения хромогенного субстрата. для щелочной фосфатазы, регистрации интенсивности окрашивания, отмывания первого субстрата и внесения хромогеннЬго субстрата для пероксидазы н повторной регистрации интенсивности окрашивания.

1291155

Компоненты тест-системы с двойной иммуноферментной меткой

Эксперимент

АнтиДНФ-анти емыши

Антитела пероксидаза

IgG-изотипа

IgM-изотипа

18/98 29/98 щелочная фосфатаза гаптен

ДНФ

24/98 ? 6/98 гаптен

ДНФ

Составитель M.Васильев

Редактор И.Горная Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга

Заказ 63/7 Тираж 596 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Вторичный иммунный ответ на

Первичный иммунный ответ на

Конъюгат анти-IgM мыши

Конъюгат анти-IgG мыши— пероксидаза

Частота выявления культур (клонов иммунокомпетентных клеток, продупирующих тестируемые иммунореактанты