Штамм бактерии bacillus thuringiensis var. dendrolimus - продуцент -эндотоксина

 

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано для производства биоинсектицида, применяемого в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с вредными насекомыми. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий - продуцента эндотоксина, не образующего спор. ЛК₅₀ для личинок непарного шелкопряда составляет 1,09 - 0,37% культуральной жидкости, а препарата 0,040%. Штамм фагоустойчив по отношению к фагам С/П, 25/16, 22. Штамм экологически безопасен, так как не образует спор. В сухом препарате, полученном с помощью штамма Bacillus thuringiensis var. dendrolimus ЦМПМ В-3269 (ИПМ-2а), содержится 73,2 мкг/мг эндотоксина. 3 табл.

Изобретение относится к технической микробиологии и может быть использовано для производства биоинсектицида, применяемого в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с вредными насекомыми. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, экологически безопасного, не образующего спор, но продуцирующего активный δ-эндотоксин. Штамм получен путем химического мутагенеза с помощью этилметансульфоната (ЭМС) и последующей селекции по признаку отсутствия спорообразования из штамма 49/8. Штамму бактерий Bacillus thuringiensis var, dendrolimus, не образующему спор, присвоен N ИПМ-2. Он хранится в коллекции культур ВНИИ прикладной микробиологии и депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов "ВНИИгенетика", коллекционный номер В-3269. Штамм Bac. thuringiensis var. dendrolimus ИПМ-2а имеет следующую морфологическую характеристику. Вегетативные клетки представляют собой прямые палочки с закругленными концами, расположенные единично. Размеры клеток 1,4-1,6х4,5-7,5 мкм. Грамположительные, слабо подвижные. В стационарной фазе развития образуют кристаллы δ-эндотоксина ромбовидной формы, расположенные терминально. Характер роста на различных питательных средах. На мясопептонном агаре образует округлые, серовато-белые, полупрозрачные, мелкозернистые колонии с ровным краем, слизистой консистенции. На сухом питательном агаре рост обильный, колонии округлые, кремовато-белые, гладкие, с ровным краем, слизистой консистенции. На картофельном агаре рост обильный, колонии округлые, белые, гладкие, с ровным краем, слизистой консистенции. На ломтиках картофеля рост обильный, налет слизистый, блестящий, гладкий. Пигмент не образует. На мясопептонном бульоне образует равномерную муть. Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Усваивает с образованием кислоты без выделения газа глюкозу, мальтозу. Слабо усваивает сахарозу, ксилозу. Не усваивает салицин, лактозу, арабинозу, маннит. Разлагает крахмал, эскулин. Образует ацетилметилкарбинол. Отношение к источникам азота. Усваивает аммонийные формы. Восстанавливает нитраты. Молоко пептонизирует. Желатину разжижает. Мочевину не разлагает. Антигенные свойства. Относится к IV серотипу Bac. thuringiensis. Патогенные свойства. Токсичен для личинок непарного шелкопряда. Не продуцирует термостабильный экзотоксин. Не обладает патогенностью для теплокровных животных. Отношение к фагам. Устойчив к фагам И-77, 11, 17. Чувствителен к фагам С/П 25/16, 22. Собственных вирулентных фагов не выделяет. П р и м е р 1. Способ получения штамма ИПМ-2а. 5 мл суспензии спор (10⁸ спор/мл) Bac. thuringiensis var. dendrolimus 49/8 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, прогревают на водяной бане при 70^оС в течение 15 мин. После охлаждения суспензии до комнатной температуры добавляют 0,1 мл ЭМС и инкубируют при 28^оС на круговой качалке в течение 15-18 ч. Затем смесь центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин при 5^оС. Осадок дважды отмывают физиологическим раствором и переносят в 2,5 мл фосфатного буфера, рН 7,0. 100 мкл полученной суспензии высевают на чашки Петри с МПА и инкубируют при 30^оС в течение 2-3 сут. Выросшие колонии исследуют с помощью фазово-контрастной микроскопии и выявляют клоны без споруляции. П р и м е р 2. Штамм ИПМ-2а выращивают в течение 12-16 ч на косяке с МПА. Полученную культуру пересевают на дрожже- полисахаридную среду (ДПС) следующего состава, дрожжи 3,0; кукурузная мука 1,5; NaCl 0,5; вода водопроводная остальное, или на обогащенную дрожжеполисахаридную среду следующего состава, дрожжи 3,6; кукурузная мука 2,86; соевая мука 0,5; мел 0,3; вода водопроводная остальное. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с 30 мл среды на круговой качалке при 260 об/мин и 30^оС в течение 48 ч. 5 мл полученной культуральной жидкости в пробирке прогревают на водяной бане при 80^оС в течение 15 мин, охлаждают и высевают по 0,2 мл на 10 чашек Петри с 15-20 мл МПА. Инкубируют чашки при 30^оС в течение 48 ч. Роста клеток данного штамма не наблюдают, что свидетельствует об отсутствии спор в культуральной жидкости. П р и м е р 3. Способ получения лабораторного образца эндотоксинсодержащего препарата. Штамм ИПМ-2а выращивают на ДПС в течение 48 ч, как указано в примере 2. Получают культуральную жидкость, содержащую кристаллы эндотоксина и другие продукты метаболизма штамма, остатки лизированных вегетативных клеток и неутилизированные компоненты питательной среды. К культуральной жидкости добавляют 1,4 мас. NaCl и высушивают на распылительной сушилке марки "Biichi" при температуре на входе 170^оС. Получают порошок светло-желтого цвета. Выход сухого порошка составляет 17,5 г с 1 л культуральной жидкости. Инсектицидная активность лабораторного образца препарата на основе штамма ВТ ИПМ-2а составляет около 90% активности коммерческого препарата дендробациллина. Содержание чистого эндотоксина в готовом препарате, определяемое с помощью иммуноферментного метода, составляет 73,2 мкг/мг, а в дендробациллине не более 28,6 мкг/мг. Сравнительные характеристики инсектицидной активности культуральной жидкости (КЖ) и препарата, а также данные по фагоустойчивости штамма приведены в табл. 1, 2 и 3. Из данных, приведенных в табл. 1-3, следует, что по инсектицидной активности в отношении непарного шелкопряда и фагоустойчивости штамм ИПМ-2а находится на уровне промышленного штамма 49/8. Использование предлагаемого аспорогенного штамма Bac. thuringiensis var. dendrolimus ИПМ-2а для производства не содержащего спор биоинсектицида позволяет исключить загрязнение окружающей среды при его применении для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. dendrolimus ЦМПМ В-3269 - продуцент d -эндотоксина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2