Способ получения белка поверхностного антигена вируса гепатита в

 

Изобретение относится к области .биотехнологии и касается получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В. Цель изобретения - повьшение выхода продукта. В предложенном способе повышение выхода HBsAg обеспечивается за счет использования рекомбинантной плазмидной ДНК, которую получают в результате культивирования S.Cerevisial, трансформированных плазмидой, которая содержит маркерньш ген для E.coli и дрожжей и реплицируется как в E.coli, так и в дрожжах, при этом ген антигена в HBsAg в данном плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1УВЛИН (51) 4 С 12 N 15/ОО

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

" .м, I ц, К flATEHTY (21) 3635804/28-13 (22) 15 ° 08.83 (31) 142460/82 (32) 16.08.82 (33) JP (46) 07.04.88. 0- 13 (71) Джуридикал Фаундейшн дзе КемиСеро-Терапевтик Рисерч Институт (ЛР) (72) Ацуси Миянокара, Сикатеру Нозаки, Фукусабуро Хамада, Акио Тох-E u

Нобуяа Охтомо и Кениси Мацубара (ЛР) (53) 575.224.2.577.2/.048(088.8) (56) Pablo Valeuraela et. а1. Synthesis and assem oly of lapatitis В virus. — Surface anfi8er particles in

yast. Nature, чо1.298, July 1982, р. 347-350.

»SU „„1387878 А 3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В (57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В. Цель изобретения — повышение выхода продукта. В предложенном способе повышение выхода НВеА8 обеспечивается за счет использования рекомбинантной плазмидной ДНК, которую получают в результате культивирования S.Cerevisial, трансформированных плазмидой, которая содержит маркерный ген для Е.cali и дрожжей и реплицируется как в Е.coli, так и в дрожжах, при этом ген антигена в

HBsAg в данном плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1387878

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В.

Цель изобретения — повышение выхо5 да конечного продукта.

Повышение выхода НВзАВ обеспечивается за счет использования рекомбинантной плазмидной ДНК, которую полу- fp чают .в результате культивирования

Saccharomyces cerevisiae, трансформированной плазмидой, которая содержит маркерный ген для Е,coli и дрожжей, и может реплицироваться как в Е.coli, 15 так и в дрожжах, при этом ген антигена HBsAg в данной плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы, в котором часть или полный структурный ген кислой фосфатазы или некото- 2р рая область вверх от структурного гена кислой фосфатазы удалена.

П р и и е р 1. Собирают плазму крови (700 мл), взятую у десяти пациентов, с положительной реакцией на 25

HBsAg (подтипа adr) и íà НВеА8 затем ее подвергают центрифугированию со скоростью 5000 об/мин в течение, 20 мин с целью удаления нерастворенных материалов. Полученный в резуль- 30 тате раствор подвергают центрифугированию при 4 С со скоростью fi8000 об/мин в течение 8 ч, а полученный осадок вновь растворяют в 10 мл буфера (pH

7,5) 10 мМ Tris-HC1, 0,1 М NaCl u

1 мИ ЭДТК. Полученный раствор добавляют в верхнюю часть пробирки для центрифугирования, содержащей 30 сахарозы, которую центрифугируют при

4 С со скоростью 39000 об/мин в те- 40 чение 4 ч. Полученный в результате осадок вновь растворяют в том же буфере.

С целью облегчения последующих операций буферный раствор подвергают 45 реакции с ДНК полимеразой вируса гепатита В, при помощи его обработки в смеси (500 мкл) 67 мИ Tris-НС1 (рН

7,5), 80 мМ МН,С1, 25 мМ М@С1а, 0,5/ NP40 (тергитол, производимый фирмой "Сигма Ко"), О, 1 2-меркаптоэтанола,330 мкмдЦТФ (дезоксицитидин трифосфата),дГТФ (дезоксигуанозин тпиАосЛата) и пАТФ (дезоксиаденозин трифосфата,0, 5 мкМ Ы -(P) дТТФ (двз окситимидин трифосфата) при 37 С в течение 3 ч и в реакционную смесь добавляют тот же объем 100 мМ раствора ЭДТК.

В результате упомянутой реакции с помощью ЛНК полимеразы однонитевая область ДНК "достраивается" до полностью двунитиевой, при этом попучают материал, меченый (32P). Этот материал добавляют в верхнюю часть пробирки для центрифугирования, в которой по слоям в указанном порядке содержатся 30, 20 и 10%-ные растворы сахарозы, пробирку подвергают центрио фугированю при 4 С со скоростью

39000 об/мин в течение 4,5 ч.

С тем, чтобы разрушить ферментом протеины, прочно связанные в „ДНК, полученные осадки обрабатывают в смеси 1 мг/мл проназы Е, которая производится фирмой "Какен Кагаку К.К." и 0,2 -ного водного раствора лаурил сульфата натрия при 37 С в течение

2 ч. Полученную в результате смесь дважды экстрагируют фенолом (200 л),,з полученный в. результате экстракт, содержащий ДНК, промывают простым эфиром с тем, чтобы удалить фенол, пасле чего получают раствор ДНК вируса гепатита В. Полученная таким образом ДНК обладает удельной радиоактивностью 2,5х10 отсчетов/мин на .1 мкс.

Полученную двунитевую кольцевую

ДНК вируса гепатита В (ВГВ) клонируют с использованием ДНК Л -фага Шарон

16А в качестве вектора, а затем вновь клонируют в плазмиду рАСУС177.

ДНК ВГВ (20 нг) обрабатывают эндонуклеазой Xho 1 в смеси (20 мкл)

10 мМ Tris — НС1 (рН 7,4), 7 мМ МяС1, 100 мМ NaC1 и 7 мМ 2-меркаптоэтанола при 37 С в течение 2 ч. Полученную в результате смесь экстрагируют фенолом (20 мкл) и затем простым эфиром, а в водный слой добавляют двойной объем охлажденного этанола с тем, чтобы

ДНК выпала в осадок. Смесь выдержио вают при -70 С в течение 1 ч, а затем центрифугируют со скоростью

f0000 об/мин в течение 5 мин, a осажденную ДНК извлекают, Полученные таким образом осадки отделяют и растворяют в смеси (5 л) 10 MM Tris-НС1 (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК. ДНК ВГВ и равномолярное количество ДНК -фага Ша- рон 16А (имеющей один сайт "узнавания" для Xho I), полученная в результате рассечения эндонуклеазой сечения

Xho I тем же методом, что использовался выше, обрабатывают ДНК-лигазой Т4 смесь 50 мМ Tris-НСl (рН 7,4), 10 мИ MgCl< 10 мМ дитиотрейтола, 1387878

10 мкг/мл альбумина сыворотки теленка, 0 5 мМ АТФ и 0 5 мкл лигазой Т4, производимой фирмой Тикара биомедикалз, 1-5.10 единиц/мл при 4 С в те- 5 чение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и простым эфиром, а затем подвергают осаждению фенолом. !

Полученные таким образом осадки растворяют в смеси (10 мкл) 1О мИ Tris-10

НС1 (рН 7,4) и 1 мИ ЭДТК.

Рекомбинатную ДНК упаковывают и получают 7, -фаги, которые затем на плоском L-arape (23х23 см) образуют бляшки (10 ) с использованием SupF 15

ДР50 Е. coli в качестве индикатора.

Такие бляшки подвергают гибридизации с использованием в качестве зонда

ДНК ВГВ, меченой 3 р, с тем, чтобы можно было выделить бляшки, образованные фагом, содержащим ДНК ВГВ. ДНК фага получают с использованием ДР50SupF Е.coli в качестве инфецируемой бактерии, Полученную таким образом

ДНК обрабатывают ферментом Xho Е при 25 тех же условиях, что описаны, в течение 2 ч и полученную в результате реакционную смесь подвергают электрофорезу с использованием 0,75Å агарового геля с целью выделения ДНК ВГВ 30 (3,2 кб). ДНК ВГВ абсорбируют на

ДЭАЭ (диэтиламиноэтил целлюлоза бумагу, производимую фирмой "Тойо

Роши, Япония) с тем, чтобы отделить

ДНК носителя, а затем элюируют 1 M водным раствором NaC1 с тем чтобы получить ДНК ВГВ, имеющую Xho 1 сайты с обеих сторон.

Отдельно плазмиду рАСУС!7.7, содержащую единственный сайт сечения 40

Xho 1 внутри ее гена стойкости к канамицину, обрабатывают Xho 1, а продукт подвергают очистке при помощи экстракции фенолом, обработки простым эфиром и осаждению этанолом. 45

Полученную таким образом плазмиду рАСУС177, рассеченную ферментом Xho

1 ДНК ВГВ в молярном отношении 1:5, а смесь "сшивают" ДНК Т4-лигазой в течение 18 ч.

Выделение ДНК (10 мкл) осуществляют следующим образом: обрабатывают культуральный бульон штамма Е.coli

4 776, эту смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 0 С в течение

25 мин. Смесь помещают на 1.-агаровую пластину, содержащую ампициллин (20 мкг/мл), Ы-биотин (1 мкг/мл), диаминопимелиновую кислоту (100 мкг/мл) и тимин (Zn мкг/мл), и инкуюируют при 37 С в течение ночи. Полученные в результате колонии помещают на агаровую пластинку, содержащую канамицин (20 мкг/мл), на агаровую пластинку, содержащую ампициллин (20 мкгlмл) причем колонии, которые растут только на агаровой пластинке, содержащей ампициллин, отбирают рАСУС 177 содержит ген стойкости к ампициллину и ген стойкости к канамицину, но когда ДНК-ВГВ встраивается в сайт

Xho 1 гена стойкости к канамицину, он теряет свойство стойкости к канамицину. В соответствии с этим выбранные колонии содержат рекомбинантную ДНК рАСУС 177-ДНК ВГВ. Из выбранных таким образом колоний получают плазмиду, т,е, рекомбинантную ДНК рАСУС 177 — ДНК ВГВ (которую обозначают через "рНВУ"), обрабатывают ферментом Xho 1, в результате получают весь фрагмент ДНК ВГВ (3,2 кЬ) °

Когда плазмиду обрабатывают ферментом Xho 1 и ферментом ВамН 1, то получают фрагмент (примерно 1,3 кЬ), содержащий ген HBsA8.

Фрагмент EcoRI в примерно 8000 нуклеотидных пао (8 кЬ), содержащий ген полипептида (Р60) в 60000 дальтон, который составляет репрессируемый ген кислой фосфатазы, получают из банка генов $288С дрожжей и вставляют в сайт EcoRI плазмиды pHR322 Е.coli, в результате чего получают исходную плазмиду.

Исходную плазмиду обрабатывают эндонуклеазой Ба1 и сшивают ДНК лигазой Т4, при этом получают плазмиду рАТ25, которая имеет пробел от сайта SaI 1 до фрагмента гена кислой фосфатазы 5,2 кЬ. Плазмида рАТ 25 является плазмидой, содержащей фрагмент (примерно 3,7 кЬ) от сайта EcoRI до сайта SaI I в pBR322 который содержит ген стойкости к ампициллину и фрагмент (примерно 2,8 кЬ) от сайта

EcoRI до сайта SaI 1 гена дрожжей кислой фосфатазы.

В EcoRI сайт рАТ ?5 вставляют Арагмент FcoRI (1,4 кЬ), содержащий ars

1 и ген Trp 1, который получают в результате обработки плазмиды УКР 7 ферментом FcoRI, при этом получают плазмид рАТ 26, Фрагмент ars 1-Tr р 1 содержит единственный сайт указывания для фермента сечения Hind III внутри гена Ттр 1.

1387878

В сайт Hind III плазмиды рАТ 26 вставляют Hind III — фрагмент, содержащий Len 2 и 2 p ori, который получают в результате обработки плазмиды pHLE 1 ферментом Hind III c

5 тем, чтобы получить челночный вектор рАТ.77. рАТ 77, содержащийся в S.cerevisiae (т.е. Saccharomyces cerevisiae AH 22 (рАТ 77) сдан на хранение в Исследовательский Институт Ферментации, Агенство по промышленной науке и технологии, Япония, в соответствии с Будапештским соглашением "FEPN

ВР-324") .

Полученный таким образом рАТ 77 (i мкг) рессекают ферментом Баl i а затем обрабатывают эксонуклеазой

BAL 31 (О, 1 U) в растворе (50 мкл)

20 мМ Tris †Í (pH 8,2), 12 мМ СаС1, 20

12 мМ MgCI< 0,2 М, NaC1 и 1 мМ ЭДТК в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные в результате осадки обрабатывают лин-25 кером Xho 1 (1 нмоль) и ДНК вЂ” лигазой

Т 4 при тех же условиях что описаны, в течение 12 ч.

Трансформируют Е.coli Х 1776 полученной плазмидой и получают трансфор- 30 мированную культуру, стойкую к ампициллину, Из колоний вьделяют ДНК плаз-. миды, определяют нуклеотидную последовательность ДНК, а затем определяют область гена кислой фосфатазы, удаленную при помощи BAL 31. Среди этих

ДНК отбирают и вьделяют искомые плазмиды pAN 81, рАМ 82, рАМ 83 и pAN 84, в которых полностью отсутствует структурный ген фосфатазы.

Обозначают "А" в кодоне ATG, кодирующем первую аминокислоту (метионин) продукта Р60 структурного гена фосфатазы, через "+ 1, в этих челночных носителях удаляют следующие области, рАМ 81: до +2, рАМ 82: до — 33, pAN

83". до -50 и рАМ 84: до -51. рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, содержащиеся в Saceharomyces serevisiae (т,е.Басеharomyces cerevisiae АН 22 (pAN 81, 50

АН 22) рАМ 82, АН 22 (рАМ 83 и AH 22)

pAN 84, сданы на хранение в Исследовательский Институт ферментации, Агенство по промышленной науке и технологии. Япония, в соответствии с Будапештским соглашением "FEPM BP-325", "FEPN ВР-3 13", РЕРМ BP-327" и "FEPM

ВР-326".

Полученную ДНК ВГВ в результате обработки плазмиды рНВУ (рАСУС 177ДНК ВГВ) ферментом Xho 1 подвергают рекомбинации с челночным вектором, рассеченным Xho 1, рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84 в молярном отношении

5: 1 при помощи "сшивки" ДНК лигазой

Т4.

Е,coli Х 1776 трансформируют данной ДНК плазмидой, получают из трансформированной культуры стойкие к ам— пициллину колонии, Выделяют из них

ДНК и анализируют с использованием различных ферментов сечения таких, как Xho 1, Xha 1 и Hind III, при этом идентифицируется вставка ДНК ВГВ в носители и ее направление.

Фрагмент гена HBsAg (3 мкг), полученный в результате рассечения плазмиды рНВУ ферментом ВамН1, обрабатывают ДНК вЂ” полимеразой Т4 (0 2U) в растворе (100 мкл) 67 мМ Tris-НС1 (рН 8,6), 6,7 мМ MgCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 6,7 мкМ ЭДТК и 16,7 мМ (NH<)> SOD, который содержит 200 мкМ

МАТФ,,ЩТФ, АТТФ иАГТФ в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить конец сечения ферментом ВамН1. Реакционную смесь подвергают экстрагированию фенолом и осаждению этанолом. Осадки подвергают реакции сшивания с линкером Xho, 1 в молярном отношении 1:10 при помощи ДНКлигазы Т4. После экстрагирования фенолом и осаждения этанолом ДНК плазмиды обрабатывают Xho 1, при этом получают фрагмент гена HBsAg (примерно

1,3 кб), содержащий терминал сечения

Xho 1 на обоих концах, Этот фрагмент сшивают с "челночным" вектором рАМ 82, который рассекают ферментом Xho .1, в молярном отношении 5:1 с использованием ДНК вЂ” лигазы Т4, трансформируют кишечную палочку E.coli Х 1776 полученной рекомбинантной ДНК.

В эту плазмиду вставляют HBsAg ген в правильном направлении вниз от промотора фосфатазы вектора рАМ 82.

Исходными дрожжами являются Басеharomyces cerevisiae АН22 (а, lеп 2, his 4, eau% (Cir+)), которые сданы на хранение в Исследовательский институт ферментации, Агенство по промышленной науке и технологии, Япония, в соответствии с Будапештским соглашением под наименованием "FEPM BP-3 12". Исходные дрожжи помещают на среду yPD (100 мл), содержащую 2Х полипептона, 1Х экстракта дрожжей и 27. глюкозы, затем смесь

7 13878 инкубируют при 30 С в течение ночи и далее клетки собирают при помощи центрифугирования. Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мп), суспендируют в раствор 1,2 М сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы -60000 (которая производится фирмой "Сейкагаку Когио К.К.", Япония), суспензию выдерживают при 30 С в течение 30 мин, в результате чего получают сферопласт. Полученный таким образом сферопласт промывают 1,2 M раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в раствор (0,6 мл) 2 M сорбита, 10 мМ СаС1< и 10 мМ Tris

НС1 (pH 7,5) . Суспензию реализуют в маленькие пробирки в объеме 60 мкл. В суспензию добавляют раствор рекомбинантной плазмиды рАН 203 (30 мкл) . 20

После тщательного перемешивания в смесь добавляют О, 1 M СаС1g(3 мкл) до комнатной концентрации СаС1 в

10 мМ, затем смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 5- 25

10 мин. В полученную в результате смесь 1 мл раствора 20 полиэтиленгликоля 4000, 10 мМ СаС1у и 10 мМ

Tris — НС1 (рН 7,5), затем смесь выдерживают при комнатной температуре в30 течение примерно 20 мин. Смесь (каждую объемом 0,2 мл) добавляют в среду (10 мл)> состоящую íà 22Х из сорбита, на 2Х из глюкозы, на 0,7Х из аминокислоты на основе азота дрожжей, 3 на 2 из УРЭ, на 20 мг/мп из гистидина и на З из агара и выдерживают о при постоянной температуре в 45 С.После энергичного перемешивания смесь помещают слоем на пластинку с мини- 40 мальной средой, содержащей 1,2 М сорбита, которую приготавливают заранее, она содержит О, 7 аминокислоты на базе азота дрожжей, 2Х глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 2Х агара, Плас-45 тинку инкубируют при 30 С, в результате чего получают колонию дрожжей,не зависящих от леуцина.Колонию инкубирунт в минимальной среде Берк Хольдера с добавкой гистидина (20 мкг/мл) 50 в результате чего получают искомые трансформированные дрожжи:Saceharomyсея cerevisiae pAH 203.

Тем же способом, однако вместо рекомбинантного рАН 203 используют рекомбинантные плаэмиды, PAS 101, рАН

20 1 и рАН 205; получают следующие трансформированные дрожжи:Saceharomy

78 8 сез cerevisiae pAS 101, S ° Cerevisiae ,рАН 201, S.Cerevisiae рАН 205.

Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на агаровую пластинку с минимальной средой Берк Хольдера, дополненной гистидином (20 мкг/мл) и осуществляют инкубирование при

30 С до образования колонии. Полученные в результате клетки отделяют от колонии, прививают на минимальную среду Берк Хольдера, дополнительную гистидином (20 мкг/мл) и инкубируют при 30 С. Спустя примерно

24 ч клетки в стадии логарифмического роста собирают центрифугированием, суспендируют в минимальную среду (10 мл), но содержащую фосфорную кислоту (которая приготавливается заменой КН РО в минимальной среде Берк

Хольдера на КС1 и последующим добавлением 20 мкг/мл гистидина), с концентрацией клеток примерно 4х10 кле6 ток/мл. После инкубирования при 30 С в течение примерно 24 ч культуральный бульон подвергают центрифугированию со скоростью 4000 об/мин в течение 10 мин с целью сбора клеток.

Собранные таким образом клетки суспендируют в, раствор (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ буфера фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэтанола и 100 г/мл

Зимолиазы — 60000 (производимой фирмой "Сейкагаку Когио К.К", Япония), а затем смесь энергично встряхивают о при 30 С в течение 30 мин с тем, чтобы получить сферопласт. Сферопласт собирают при помощи центрифугирования и тщательно суспендируют в.раствор (1 мл) 0,1 тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), суспензию энергично перемешивают, а затем центрифугируют со скоростью 7000 об/мин в течение 10 мин, при этом верхний слой образует раствор лизированных дрожжей.

Полученный раствор (20 мкл) ис-, пытывают с использованием устройства для РИА на НВ$ антиген (производимо- го фирмой "Эбботт", США) по HBS антигенной активности. Результаты приведенц в таблице, Что касается раствора лизированных дрожжей, полученного из S.cerevisiae АН 22/рАН 203, то предполагается, что активность и количество антигена находятся в соответствии статической параллельной п, ямой при использовании устройства для обнаружеХозя

S. cerevisiae

AH 22 (1 ЕРЧ RP-312) рАН 201 10.597 рАН 203 13. 008 рАН 205 5.548

9 138787 ния HBsAg, причем в качестве контрольного антигена используется очищенный

HBsAg полученный из сыворотки крови человека.

Дозированный раствор (каждая порция 0,4 мл) подкожным способом вводят гвинейским свинкам (самки, 300-380 г, 10 животных) один раз в неделю в течение трех недель,а антитела в плазме10 крови определяют при помощи устройства для обнаружения анти-НВ$ антител (АУСАБ, производимого фирмой "Эбботт", США). В результате у всех животных обнаружены айти-HBS антигена, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

1. Способ получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В, включающий конструирование челночного вектора путем объединения фрагмента ДНК Saceharomyces cerevisiae, содержащего ars 1,2 р ori и селективный маркер для отбора трансформированных

S.cerevisiae с фрагментом ДНК Escherichia co1i, содержащим ген реплика- ции плаэмиды, а также селективный маркерный ген для отбора трансформированных плазмидой Е.coli введение н него участка ДНК, кодирующего ген поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) который находится под контролем дрожжевого промотора, с последующим культивированием трансформированных плазмидой S.cerevisiae, выделением и очисткой целевого продукта,35 отличающийся тем, что, с целью повышения выхода конечного продукта, конструирование вектора осуществляют введением в Е.coRI сайт

40 плазмиды pBR322 гена кислой фосфатазы Р60, выделенного из банка генов

S 288С дрожжей, далее обрабатывают эндонуклеазой Sal I и ДНК-лигазой

8 10

Т4 и получают плазмиду рАТ25, включают в Sal I плазмиды рАТ25 фрагмент

arsI-trpI, выделенный из плазмиды

4Р7, полученную плазмиду рАТ 26 обрабатывают эндонуклеазой Hind III и вводят фрагмент 1.еп 2 и 2 p ori плазмиды pS2F, после чего полученный вектор рАТ77 и AparMeHT ° содержащий ген НВзАВ подтипа ad r, выделенный из плазмиды рНВЧ с помощью фрагмента Bam HI, обрабатывают эндонуклеазой Xho I сшивают полученные фрагменты ДНК-лигаэой Т4 и отбирают рекомбинантные плазмидные ДНК; в которых ген HBsAg расположен ниже области промотора.

2. Способ по и. 1 о т л и ч а юшийся тем, что вектор рАТ77 рассекают эндонуклеазами Ба11 и Bgl 3 1, добавляют Xho I линкер и полученную смесь обрабатывают ДНК-лигазой Т4, у полученных плазмид определяют нуклеотидную последовательность и выбирают плазмиды рАМ до +2, рАМ от 82 до

-33, рАИ 83 до -50 и рАМ 83 до -51, из которых удалена часть гена Р60.

3, Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что плазмы крови больных гепатитом В выделяют ДНК вируса,однонитьевую ДНК удваивают с помощью ДНК-полимераэы 1,полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазой ХЬо 1 и клонируют в Xho 1 сайт ДНК Л -фага

Шарон 15А, выделенные гибридиза цией с меченной Р ДНК вируса гепатита В, ДНК фагов и плазмиду рАСУС/77 обрабатывают Xho (эндонуклеазой, полученные фрагменты clUH вают ДНК-лигаэой Т4, далее трансформируют полученным рекомбинантными ДНК клетки Е.coli и отбирают рекомбинантную плазмиду рНР4, содержащую ген

НВsAg.

1387878

Продолжение таблицы рА 101 1.200

Контрольный рАИ 82* 320

* Этот носитель не содержит ни гена В В, ни гена HBS и используется в качестве отрицательного контрольного клона (отрицательный контрольный клон с использованием устройства

РИА имеет активность в 310 отсчетов/ мин, а положительный контрольный клон имеет тот же показатель в

17500 отсчетов/мин.

Составитель Н.Кузенкова

Редактор С.Патрунева Техред Л.Сердюкова Корректор М,Максимишинец,Заказ 1502/59 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4