Рекомбинантная плазмидная днк psth 2191, кодирующая синтез соматотропина человека, и штамм escherichia coli - продуцент соматотропина человека

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генетической инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pSTH 2191, кодирующую синтез соматотропина человека, и штамм E. Coli, несущий эту плазмиду. Цель изобретения состоит в повышении выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что сконструированы рекомбинатная плазмидная ДНК pSTH 2191 и штамм E. coli, содержащий эту плазмиду. Плазмида модифицирована так, что последовательность участка, расположенного между trp-промотором и инциирующим ATG-кодоном, встроенным перед последовательностью, кодирующей соматотропин человека, заменена на последовательность, которая обеспечивает более высокий синтез целевого продукта. Штамм-продуцент соматотропина человека получен трансформацией клеток E.coli К 802 плазмидной pSTH 2191. Уровень синтеза гормона в штамме при плотности 4×10⁸ клеток/мл составляет 15-20 мг/л. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR - 267Д. 3 ил.

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генетической инженерии и биотехнологии, а именно к рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей вариант соматотропина человека, штамму Escherichia coli, содержащему эту плазмиду , - продуценту соматотропина человека. Цель изобретения состоит в повышении выхода целевого продукта. Повышение выхода соматотропина обеспечивается за счет модификации плазмиды ДНК pSTH 19-I/P-trp так, что последовательность участка, расположенного между trp-промотором и инициирующим ATG-кодоном, встроенным перед последовательностью, кодирующей соматотропин человека (участка инициации трансляции) заменена на другую нуклеотидную последовательность, которая обеспечивает более высокий синтез целевого продукта. Сущность рекомбинантной плазмидной ДНК pSTH 2191 (см.фиг.1) состоит в том, что она содержит репликон плазмиды pBR 322, фрагмент, содержащий промотор триптофанового оперона E.coli и фрагмент к ДНК соматотропина человека, кодирующий с 2-й по 191-ю аминокислоту гормона, перед которым встроен ATG-кодон (см.фиг.3), а именно состоит из следующих элементов: плазмидной ДНК вектора pBR 322 с 29-й по 4168 п.о., размер которой 4140 п.о., фрагмента ДНК, содержащего trp-промотор E.coli, встроенный между геном bla плазмидной ДНК pRB 322 и единственным EcoRI-участком расщепления, размером 1176 п.о., EcoRI - Hind III - фрагмента, содержащего ДНК, кодирующую с 2-й по 191-ю аминокислоту СТГ, размером 713 п.о., перед которой встроена последовательность СAATTCTATG. Размер гибридной плазмиды pSTH 2191 составляет около 6000 п.о. Копийность плазмиды около 20 молекул на клетку. ДНК плазмиды pSTH 2191 содержит уникальные сайты рестрикции EcoRI, Hind III, BamHI, EcoRV, BglII, HpaI, SalGI и SmaI и 2 сайта рестрикции Pst I. Положения всех перечисленных сайтов рестрикции относительно EcoRI сайта показаны на фиг.1. В состав плазмиды pSTH 2191 входят гены: bla-ген, обеспечивающий синтез β -лактамазы (устойчивость к ампициллину); tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину; STH-модифицированный ген соматотропина человека, кодирующий met-СТГ2-191. Штамм - продуцент соматотропина человека - получен трансформацией клеток E.coli К 802 плазмидной pSTH 2191. Уровень синтеза гормона по данным простой радиальной иммунодиффузии в штамме-продуценте составляет при плотности культуры 4х10⁸ клеток/мл 15-20 мг/л. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-267Д. П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pSTH 2191. Схема конструирования представлена на фиг. 2. 10 мкм плазмиды pSTH 19-1.P-trp гидролизуют рестриктазой EcoRI в 50 мкл инкубационной смеси следующего состава: 100 mM NaCl, 50 mM трис-HCl, рН 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM дитиотрейтола, 10 ед. рестриктазы EcoRI, в течение 1 ч при 37^оС. Полноту гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. К смеси добавляют 2,5 мкл 0,25 М раствора ЭДТА, 50 мкл смеси фенолхлороформ (1:1), встряхивают, в течение 30 с и разделяют фазы центрифугированием. Водную фазу экстрагируют равным объемом (50 мкл) хлороформа, затем добавляют к ней 5 мкл 3М ацетата натрия. рН 6,0, 150 мкл этанола. Смесь охлаждают при - 70^оС в течение 10 мин и ДНК осаждают центрифугированием на центрифуге "Эппендорф"в течение 10 мин. ДНК растворяют в 50 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (500 мкг/мл), добавляют 50 мкл буфера, содержащего 24 mM CaCl₂, 24 mM MgCl₂, 0,4 M NaCl, 40 mM трис-HCl, рН 8,0 и 2 mM ЭДТА и смесь инкубируют при 20^оС в течение 3 мин. Затем добавляют 1 мкл препарата нуклеазы BaI 31 (100 ед/мл). Через 1, 2, 3, 4 и 5 мин отбирают по 20 мкл инкубационной смеси и переносят в пробирки с 2 мкл 0,2 М ЭГТА, рН 8,0, охлажденные во льду. Инкубационные смеси объединяют и ДНК очищают путем экстракции равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1), хлороформа и переосаждают спиртом. ДНК растворяют в 50 мкл воды. К 10 мл раствора ДНК добавляют 2 мкл буфера, содержащего 500 mM NaCl, 100 mM трис-HCl, рН 7,5, 100 mM MgCl₂ и 10 mM дитиотрейтола, по 1 мкл 1 mM растворов dATP, dCTP, dTTP и dGTP, 2 мкл H₂O и 2 мкл (1 ед./мкл) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 E.coli. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к смеси добавляют 10 мкл раствора форсфорилированного синтетического олигонуклеотида 5-ATCGAATCGAT-3 (1,0 мкг) в 66 mM трис-HCl буфере, рН 7,5, содержащем 1 mM АТР, 10 mM MgCl₂ и 15 mM дитиотрейтола, 2 мкл 10 mM раствора АТР и 2 мкл ДНК-лигазы фага Т4 (1 ед./мкл). Смесь инкубируют при комнатной температуре 6 ч, затем к ней добавляют 1 мкл 0,25 М раствора ЭДТА и обрабатывают равным объемом смеси фенол-хлороформ и равным объемом хлороформа. ДНК осаждают этанолом, как это описано ранее, и растворяют в 20 мл H₂O. Далее ДНК гидролизуют рестриктазами ЕCoRI (30 ед.) и EcoRV (2 ед.) в стандартных условиях, обрабатывают смесь фенол-хлороформ, хлороформом и переосаждают этанолом. ДНК растворяют в 10 мкл Н₂О и фракционируют с помощью электрофореза в 5% -ном полиакриламидном геле, гель окрашивают бромистым этидием, вырезают полоску геля, содержащую фрагменты размером 5100-5200 п.о., и элюируют их из геля. Таким образом получают смесь плазмид для клонирования фрагмента, кодирующего соматотропин. В том же полиакриламидном геле разделяют двойной EcoRI-EcoRV гидролизат исходной плазмиды pSTH 19-I/P-trp (2 мкг) и выделяют из геля меньший фрагмент размером 869 п.о., содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую соматотропин человека. После переосаждения спиртом фрагменты ДНК растворяют в 10 мкл Н₂О. Лигирование ДНК проводят в инкубационной смеси следующего состава: 1 мкл раствора плазмид (5100-5200 п;о.), 1 мкл раствора EcoRI-EcoRV - фрагмента (860 п.о.), 2 мкл 10 х лигазного буфера, 15 мкл Н₂О, 1 мкл ДНК лигазы фага Т4 (1 ед. /мкл); 10 х лигазный буфер содержал 0,66 mM трис-HCl, рН 7,5, 50 mM MgCl₂, 50 мМ дитиотрейтола и 10 мМ АТР. Инкубируют 4 ч при 14^оС и затем 12 ч при 4^оС. К инкубационной смеси добавляют 30 мг 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и трансформируют клетки штамма E.Coli НВ 101. 50 мл УТ-среды заражают 1-2 мл ночной культуры клеток штамма E.coli HB 101 и выращивают на качалке при 37^оС до плотности 0,6 при 550 нм. Клетки собирают центрифугированием на холоде при 10000 об/мин в течение 10 мин. Осадок суспендируют в 25 мл холодного раствора: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50-70 мМ хлористого кальция, и выдерживают во льду 30 мин. Последующие операции проводят также в ледяной бане. Затем клетки снова осаждают в том же режиме и суспендируют в 2,5 мл того же раствора и оставляют на 30 мин. Лигазную смесь в объеме 50 мкл добавляют к 100 мкл полученной суспензии клеток и выдерживают 20 мин во льду, затем 2 мин при 42^оС, после чего 10 мин при комнатной температуре. К каждой пробе добавляют 2 мл свежей УТ-среды и подращивают клетки 1 ч на качалке при 37^оС. Клетки из исходной пробирки и из пробирок с разведением 1:10 и 1:100 высевают на чашки с УТ-агаром (5 г дрожжевого экстракта, 8 г бактотриптона, 5 г NaCl, 15 г бактоагара на 1 л среды) и антибиотиками (20 мг ампициллина и 20 мг тетрациклина на 2 л) по 0,5 мл на чашку. Колонии на чашках вырастают через 1420 ч при 37^оС. Отбирают колоны, устойчивые к ампициллину и тетрациклину, и анализируют в них содержание гормона. Для этого клетки выращивают в 5 мл среды (0,5% дрожжевого экстракта, 0,8% бактотриптона, 0,5% хлористого натрия, рН 7,6), содержащей 20 мг/л ампициллина и 7 мг/л тетрациклина, при 37^оС до оптической плотности 1 при 550 нм. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,2 мл раствора 1 (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0). Затем добавляют 0,2 мл раствора 2 (0,2 н. NaOH, 0,02% SDS) и суспензию инкубируют 5 мин при 0-5^оС. Далее добавляют 0,1 мл раствора 3 (150 мМ трис-HCl, рН 8,0, 280 мМ MgCl₂ 4 мМ CaCl₂). Через 5 мин суспензию центрифугируют 10 мин при 12000хG, супернатант отбирают и переносят в чистую пробирку. Для приготовления агаровой пластинки два стекла размером 6х9 см или 9х12 см с проложенными по краям прокладками толщиной 1,5 мм скрепляют металлическими зажимами и заклеивают снизу пластырем или липкой лентой. Готовят 1,5% -ный раствор бактоагара (Дифко) в 10 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,2, охлаждают его до 40^оС, добавляют 1/20 ч. водного раствора кроличьей лиофилизированной сыворотки к СТГ (40 мг/мл), полученную смесь заливают в форму. После затвердения агара одно из стекол снимают и в толще агара вырезают цилиндрические лунки диаметром 1,8 мм на расстоянии 1 см друг от друга. В лунки N 1-5 вносят по 6 мкл стандартных растворов СТГ с концентрациями 200, 100, 50, 25 и 12,5 мкг/мл соответственно. В лунку N 6 вносят 6 мкл лизата клеток. Пластинку инкубируют во влажной камере при 37^оС. Через 4 ч в агаре формируются видимые невооруженным глазом круги преципитации. Измеряют диаметр кругов преципитации и по данным для стандартных растворов СТГ строят калибровочную кривую зависимости квадрата диаметра круга от концентрации гормона, по которой определяют концентрацию гормона в лизате. Клетки из 3 мл ночной культуры осаждают в настольной центрифуге "Эппендорф" при 10000хG 2 мин. Осадок клеток суспендируют в 100 мкл раствора 1:2 мг/мл лизоцима, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0. Пробирки помещают в лед на 30 мин. Последующие операции также проводят во льду. Далее добавляют 200 мкл раствора 2:0,2 н. гидроокись натрия, 1% додецилсульфата натрия, и хорошо перемешивают. Через 5 мин добавляют 150 мкл 3М раствора ацетата натрия рН 4,8, перемешивают и оставляют на 1 ч. Затем раствор центрифугируют 5 мин при 10000хG. Из супернатанта плазмиду осаждают спиртом и растворяют в 50 мкл воды. Таким образом выделяют около 50 мкл плазмиды. Далее выделенные плазмиды анализируют с помощью электрофореза в 1% -ном агарозном геле без предварительного расщепления и после гидролиза рестриктазами. Для уточнения структуры плазмидных ДНК проводят анализ нуклеотидной последовательности в участке между EcoRI- и HpaI-сайтами. На основании определения содержания гормона, рестрикционного анализа и определения первичной структуры была отобрана плазмида, обозначенная pSTH 2191, кодирующая синтез соматотропина, представляющего собой смесь двух вариантов гормона (дез-Фен¹)-соматотропина и (дез-Фен¹-Про²)-соматотропина примерно в равном отношении. П р и м е р 2. Получение штамма E.coli K 802 - продуцента соматотропина человека, не содержащего N-концевого метионина. Плазмиду pSTH 2191 трансформируют в штамм E.coli К 802 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм - продуцент соматотропина человека. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-267Д. Содержание гормона в биомассе определяют путем лизиса бактерий и измерения гормона в лизате методом простой радиальной диффузии в агаре, как это описано в примере 1. Содержание гормона составляет 15-20 мг на 1 л культуры при выращивании штамма до плотности ОД₅₅₀ = 1, что в 2,2 раза превышает содержание гормона в штамме прототипа ВКМ R 26-Д. Штамм E.coli К 802, содержащий рекомбинантную плазмиду pSTH 2191 характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культурные признаки. Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. При росте на питательном агаре "Дифко" колонии гладкие, круглые, блестящие, серые, края колоний ровные. При росте в жидких средах УТ, LB образуют ровную интенсивную муть. Физико-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37^оС, оптимум рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной или нитратной форме, так и органические в виде пептона, триптона, аминокислот. Устойчивость к антибиотикам. Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды. Проявляют устойчивость к тетрациклину 20 мг/л на агаре, 5-7 мг/л в жидкой среде. Для получения соматотропина человека, не содержащего N-концевого метионина, проводят культивирование штамма ВКМ CR 267Д на питательной среде известного состава, собирают биомассу бактерий центрифугированием, проводят разрушение клеток и экстракцию из них белков и гормон очищают от бактериальных белков, используя известные методы.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSTH 2191, кодирующая синтез соматотропина человека, размером 6,0 т.п.о., состоящая из: плазмидной ДНК вектора pBR 322 размером 4,14 т.п.о.; фрагмента ДНК, содержащего trp-промотор E.coli, размером 1,17 т.п.о., EcoRI-Hind III-фрагмента реконструированной к ДНК соматотропина человека размером 713 п.о., 1 участка расщепления рестриктазы EcoRI; 1 участка расщепления рестриктазы Hind III, расположенного на расстоянии 713 п.о. по часовой стрелке от EcoRI-сайта, 1 участка расщепления рестриктазы BamHI, расположенного на расстоянии 1059 п.о. по часовой стрелке от EcoRI-сайта, 1 участка расщепления рестриктазы SalGl, расположенного на расстоянии 1334 п.о. по часовой стрелке от EcoRI-сайта, 2 участков расщепления рестриктазы PstI, расположенных на расстоянии 139 и 4302 п. о. по часовой стрелке от EcoRI-сайта, 1 участка расщепления рестриктазы HpaI, расположенного на расстоянии 39 п.о. против часовой стрелки от EcoRI-сайта и имеющая генетические маркеры: bla-ген, обеспечивающий синтез β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), расположенный в участке от 1200 до 2100 п.о. влево от EcoRI-сайта,tet-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный на участке размером около 1000 п.о. вправо от Hind III-сайта; перед последовательностью к ДНК соматотропного гормона слева от EcoRI-сайта располагается промоторная и операторная области trp-оперона E.coli, участок между trp-промотором и инициирующим кодоном имеет следующую нуклеотидную последовательность: + I AGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGAATTCT. 2. Штамм Escherichia coli ВКМ CR-267Д - продуцент соматотропина человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3