Способ получения l - фенилаланина
Изобретение относится к микробиологической про1Ф1тленности и касается получения незаменимой at iHOкислоты фенилаланина, которая при™ меняется э медицине, а также может служить исходш 1м продуктом при син тезе аспартама-пептида, нспользуемо го в качестве интенсивного подсластителя в пищевой промьшшенности. Целью изобретения является повышение выхода Ь-фенилаланииа и сокращение времени ферментации. Способ заключается и использовании в качестве продуцентов L-фенилаланина новых штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-3549 ИЛИ BJOM В-3550, или ВКПМ B-3S51,- или ВКПМ В-3552, устойчивык к р-фторфеиилаланину и D-тирозину. Штамм ВКПМ В-3552. устойчив еще и к гидроксаматам феннлаланнна и тирозина/ а штамм ВКПМ В-3556 - к /з-тианндаланину. fflтaм &l накапливают в среде от 8,6 до 13 г/л Ь-фенилапанина. 2 табл. . с (О с
СОВЭ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУЬЛИН
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4083581/13 (22) 30.06.86 (46) 07. 12.91. Бюл. Ф 45 (71) Всесоюзный научно-исследова" тельский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Г. А. Великжанина, T. А. Ямполь кья, Н. И. Жданова, Т. А Вачина, Н. А. Васильева, А. К. Соко" лов, E. P. Рошель, А. Ф. Шолин и Е. А. Тимохина (53) 663.I5(088.8) (56) Патент США У 4403033, С l2 Р l3/22, 1983.
Патент США 9 459l562, кл. С l2 P l3/22, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ФЕНИЛАЛАНИЯА (57) .Изобретение относится к микробиологичеСкой промышленности и ка" сается получения незаменимой амино"
„ЯУ„„1380212 А1 бра С 12 P 13/22 С i2 N l5/00 кислоты фенилаланина, которая при" меняется в медицине, а также мажет служить исходным продуктом при син" тезе аспартама-пентида, испольэуемо"
ro 8 качестве интенсивного подслас" тителя в пищевой промышленности.
Целью изобретения является повышение выхода Ь-фенилаланина и .сокращение времени ферментации. Способ заключается Э использовании в качестве нродуцентов Ь"@енилаланина новых штаммов Bacillus subtill.s ВКПИ
В 3549 или ВКПМ В-3550, или ВКПИ
В-3551; или ВКПИ В-3552, устойчивых к р-фторфеиилаланину и D-тироэину.
Штамм ВКПИ В-3552 устойчив еще и к Я гнцроксаматам фенилаланина и тирозина;" а итвим BKIIN В-3550 ". к р-тиенир- Q) аланину. Штамма накапливают в сре« де от 8,6 до l3 г/л L-@ewnanav aa.
2 табл э
1380212
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения незаменимой аминокислоты ? фенилаланина, который применяется а медицине, а также может служить исходным продуктом при синтезе аспартама-пептида, используемого.в качестве интенсивного подсластителя в пищевой промышленности.
Целью изобретения является ловы" шение выхода Е-фенилаланина и уско" рение процесса, Способ заключается в применении новых штампов Вас1.llus aubtilia полученных с помощью генетической трансформации, мутагенеэа и отбора мутантов, устойчивых к анйлогам аро" матических аминокислот, а также к 20 антибиотику митомицину С.
В качестве исходного штамма слу" жит штамм Вас. subt:ilia 924 - проду1, цент, триптофана, иэ которого получен продуцент фенилаланина генетически- 25 ми методами на основе общности путей синтеза ароматических аминокислот и того, что у продуцента триптофана в процессе селекции уже созданы определенные предпосылки и для сверх" 30 синтеза фенилапанина. Исходный штамм
924 трансформируют хромосомной ДНК донорного штамма Вас. avbtilia 39, в составе которой имеется дефектный ген trp. Е, кодирующий первый фермент в пути синтеза триптофана и геи aro Н, который кодирует высокоактивный изофермент хоризматмутаэу, отсутствующую у продуцента триптофана. В результате получают трансформанты, требующие для роста триптофан и имеющие высокий уровень активности хориэиатмутазы. Среди
I них после проверки на способность продуцировать фенилаланин отбирают трансформант, накапливающий 3 r/ë этой аминокислоты, иэ которого путем селекции получают мутант, устойчи." вый к 0,5 MKl"/мл митомицина С и выделяющий 5 г/л фенилаг:анина. Следующие этапы отбора заключаются в последовательном получении (после воздействия на клетки нитрозогуанидина) мутантов, устойчивых к аналогам ароматических аминокислот: рфторфенилаланину (рФФ) в концентрации 9 мг/мл, Д"тирозину (ДТ)
0,075 мгlмл, гидроксамату тироэина (ГТ) 1 мг/мл, гидроксамату фенилаланина (ГФ) О, 5 мг/мл, р-тиенилаланину (ТЕА) 7,5 мг/мл. В результате на разных этапах селекции получают штаммы Вас, sub) ilia ВНИИге" нетика 11„ ВНИИгенетика 33, ВНИИге" нетика I-II, От штамма Вас. aubtilis ВНИИгенетика II получен спонтанный ревертант к триптофаннезависимости прототрофный штамм ВНИИгенетика
19п, Перечисленные новые штаммы"продуценты L".ôåéèëàëàíèêà — Bac. subtilis ВНИИгенетика II Bac. subtilia
ВНИИгенетика 33, Вас. subti.lis ВНИИгенетика Х"II, Вас. subtilis ВНИИге" нетика 19п хранятся во Всесоюзном музее промышленных микроорганизмов (BIGIN) и имеют регистрационные номера В-3549, В"3552, B"3550 и В-3551 соответственно.
Штаммы имеют следующие культурально"морфологическую и физиолого-био химическую характеристики.
Основные характерис.гики новых штаммов Bac. subtilis соответствуют таксономическому описанию этого вида микроорганизмов (Стейниер P. и др. Иир микробов, т. 3, с. 184, ИИР, 1979).
Штаммы Bac, subtilis ВКПИ В"35499
ВКПИ В-3550, ВКПМ В-3551 и ВКПМ
В-3552 являются грамположительными спорообразующими палочками размером (2,5-4,5} 0,7 мкм. Размер спор (1,О1 2) (0,6-0,7) мкм.
Мясо"пептонный агар, Колонии пос" ле 24 ч инкубации при 37 С достигают
4-6 мм в диаметре, сплошные, круглые, с изрезанным краем, поверхность гладкая.
Агаризованная среда Спицайзена с
100 мкг/мл триптофана и 10 мкг/мл аденина. Колонии после 48 ч инкубации при 37 С имеют 1 мм в диаметре, поверхность гладкая, блестящая.
Отношение к источникам углерода: йспользуют глюкозу, сахарозу, мальто" зу, маннозу, маннит, глицерин, аце» тат.
Отношение к источникам азота: ас" симилируют мочевину и соли аммония.
Не растут на молоке, желатину разжижают слабо, хорошо растут на крахмале, Отношение к аналогам аминокислот: все штаммы устойчивы к р-фторфенилаланину (рФФ) и ll-тирозину (ДТ), штамм SKlTN В 3552 устойчив еще к!
380212 гидраксаматам фе««лала«ина (ГФ) и тирозина (ГТ), штамм ВКПИ В 3550 устойчив еще и к / -тиенилаланину (ТЕА).
Потребность в факторах роста: рост всех штаммов стимулируется аде«ином, штаммы ВКЛМ В"3549, В-3550 и В-3552 требуют для роста тринта фан, штамм ВКПБ В-255! не требует для роста триптофан. Отличительные признаки штаммов представлены в табл, !.
В общем виде способ получения
L-фенилаланина осуществляют следую!
5 щим образом. Клетки новых штаммов продуцентов Вас. subtilis ВКПИ
В-3549, В"3550, B-3551 и В-3552 выращивают в течение сут на агаризованной среде Хаттингера, пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли, и культивируют в течение 18-24 ч на качалке25 при 220 об/мин и 28-37 С.
Полученный посевной материал вносят.в колбы или ферментеры са стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и минеральные соли. В качестве источника углерода используют сахарозу или содержащие ее субстраты, например, технический сахар, ! в качестве источника азота - мочевииу или соли аммония, в качестве рос- 35 товых веществ - триптофан и кукурузный экстракт. Ферментацию осуществляют в течение 46-72 ч в условиях аэрации, при 28-37 С, рН 6-8, в колбах на качалке или в ферментере, при расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 400 мл/мин, скорости вращения мешалки 1000 об/мин.
В результате в культуральной жидкости накапливается до 13 г/л L-фенилаланина.
Определение содержания фенилаланина в культуральнай жидкости проводят с помощью бумажной или тонкослойиой хроматографии в системах
50 растворителей бутанол, уксусная кислота: вада (40: 0: 23) и изопропанол: аммиак (7:3) соответственна, Вйделение L-фенилалянина из культуральной жидкости осуществля" ют путем его селективной сорбции на слабоосиовном анианите с последующей десорбцией водой и повторной десорбцией нз вод«ого э«катя «л сульфаклтнаните в Н-форме (лвт. cR. СССР
К - 749889). Злюирова«55е L-фен«ляля«и«а и сульфакатианнтл горячим вод55оэта«альным раствором -аммиака получить въ5сококанцентрировл55«ы55 рлствар выделя емой аминак иола ты, 13э которо го последняя крист алли э уе тся по мере охлаждения раствора и нейтрализации аммиака кислотой.
Выделение L-фениляллни«л ло описанной схеме обеспечивает выход фен 5лялянина да 60-80%, содержа«ие основ«ага вещества в храмлтагрлфическн однородном продукте састлвляет «е менее 95%. Дополнительная 5« рекристлллизация позволяет получить препараты фениллланинл с с0.,ержл«нем
0c55osHoI Веществя не ме55ее 99%.
Пример 1. Культуру п5тлмма
Вяс. svbtilis ВКП11 В-ÇS 9 «ъ5рлщнвлют в течение 18 ч при 3 7 С 55я лглр55заваннай среде Хаттингера. Затем петлей засевают колбы объемом 250 ;ъл, содержащего 10-30 мл посев«ой среды.
Состав посевной сред5я, г/л: елклроэл; кукурузнъп5 экстрлкт 10; к„!1РО,5
1,4; КН 5РО < 0,6, три«тофа«0, 1, водопроводная вада до 1 л, р1! да стерилизации 7,2-7,5, после ст< р55лиэя" ции 7,0-7,2. Посевную среду стерили. эуют в автокллве при 0,8 лтм в течение 30 мин, После посеял колбъ5 ус" танавливяют на круговую клчалку (220 об/мин) и инкубируют при 30 С в течение 18 ч. Готовый посевной материал вносят в количестве 5% (по объему) в колбы емкостью 2000 мл с
75 мл ферментационнай среды, Сос5аа ферментационнай среды, г/л: сахароза 100;- кукуруз«ый экстракт
30, К;НРО 5 1,4; К .1.,РО 0, б; Na С1
О, S; i 1gS0 1,0, мочевиня 5,0, триптафан О, 1, водопроводная «одл да 1 л, рН среды ?,2. Иачеви«у даблвляют перед засевом в готовую среду в виде 40%-ного раствора, простерилизовянного при 0,5 атм в течении
30 мин, После засева колбы уста«ав" ливают ня качалку. Через 72 ч роста о, культуры при 30 С в культуряль«ай жидкости накапливается 10 г/л 1..-фенил лл анина. целью выделения L-фе55иллллн!5на
1 л полученного ферментациан«ого раствора пропускают через кало«ку с 0,4 л слабоосновнога анна«ита
ИА-1р. По окончании сорбцни колонку
1380212 и р и м е р 3, Выращивание по"евного материала и куль гивирОвяние штамма Вас. Su4ti13.в ВКП.л В-3551 осуществляют, как в примере 1., Отли= чием является то, что посевная и ферментационная срецы не содержат триптофаня. Через 72 ч кульгуряльной жидкости накапливается
9,1 г/л фенилаланиня„ Выделение фе" нилалянина из культуральнойл жидкос= ти осуществляют, кяк в примере 1.. 0 проьпювют 0,3 л воды, нагла чего, пОдсоединив к выходу колонки с ИА 1 р колонку с 0,07 л сульфокятионита
КУ-2"8 в И-форме, пропускают воцу уже через сиСтему из двух колонок.
После прохождения 9 л воды колонки
1 р;зъедипяют, L-фенилаланнн, пере педший с янионита ИЛ-1р на кятионит
КУ-2-8, элюируют 2%-ным растворам "0 .GMMIIGKQ B 50%-HoN водно; л 3 галане при о
О5 С, пропуская злюэнт через колонку с КУ" 2"8. Фракцию вьг Одящего раствора, содержащего Х -фениляляпин в
Концентрации более 8„0 г/л, Обрабатывают уксусной кисгьотой до рй 6,0 и охлаждают. Выпавшие кристаллы,"фенилаланиня отфильтровывают, промывают этянолом и высуп.ивяют. В результате получают 6>0 7 г кристалли- ",0 ческого продукта. с содер.калием !,-фенилаланина 977. (выход 59,87), Доиз" члечепие целевого продукта из маточ" ика и низкоконцентрированных фракций аммиачного элюата по Описанной
sI,InIe схеме(предварительно нейтрализуют аммиак уксусной кислотой и от:"опяют этанол) позволяет получить дополнительно 1,53 г кри .тяллическа"
:-о продукта (содержяние основного . 30 вещества 957), с учетом которого общий выход кристялличес Йь rîä крис т аллич еского продукта 69, 5%, содержание фениляляиина 967.. Hp и м е р 4. Посевной материRJI штаммов"продуцентов фенилаланиня Bac, subti is ВКПМ Б-3549, B-3550, R-3551 и В-3552 выращивают, как в примере 1. Готовым посевным материалом каждого штамма (20 мл) засевают 400 мл ферментационной среды того же состава, что и в примере 1, Для штамма ВКП11 В"3551 среды не содер" жат триптофяна. Культивирование ведут в лабораторных ферментерах емкостью 600 мл при 30 С, расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 400 мл в 1 мин, скорости вращения ме пялки !000 об/I H; Культивирование заканчивают, кяк тОлько из питятельнОЙ среды исчерпы" вается сахар. Результаты показаны в табл. 2. Выделение фенилаланина проводят, как в примере I Выход кристаллического продукта 77%, содержание фенилаланина 987. Пример 5. Посевной материал штамма Вас. subtilis ВКП1И В-3550 выращивают, как в примере 1, Готовым посевным материалом (20 мл) засева400 err ферментационной среды тОга же сос- àâà,,что и в примере 1, с тем отличием, что концентрация сахара в среде уменьшена до 6,57 и зместо моченины внесено 0,5% сернакислого аммония. Культивирование ведут в лабораторном ферментере, оснащенном сис" темой автоматического рН-статироваО ния, при 30 С, расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 400 мл/мин, скорости вращения мешалки 1000 об/мин. Значение рН культуральнай жидкости по церживают на уровне 7,0+0 1. В ходе культивированин в ферментер па сигналу датчика рР добавляют смесь 40%-ного раст" вор". сахаразы и 25%-ного раствора аммиака в соотношении 10:1 по объе" му. Продолжительность культивирования 58 ч,, Уровень накопления фенилалянина составляет 11,1 г/л. "ыделение Фенилаланина ведут, как в примере 1. Выход кристаллического продукта 70% содержание фенилсланина 98%. 1380212 Устойчи- Потребность Штамм вость к . в триптоаналогам+ фане ВКПИ В-3549 рФФ, ДТ Нуждается ВКПИ В-3552 PCNb, дт, ГФ, ГТ Нуждается рФФ, ДТ, TEA ВКПИ В-3550 Нуждается ВКПИ В-3551 рФФ, ДТ Не нуждается + рФФ - р-фторфенилаланин; ДТ - Д"тирозин; ГФ - гидроксамат фенилаланнна; ГТ вЂ” гидроксамат тирозинв; TEA - а -тиенилалвнин Таблица 2 » й» ° Ю Штамм Вас. subtilis ВКПИ I 1 Показатель В-3551 В-3550 В-3549 B-3552 Накопление фенилвланина, г/л 8 6 12 1 11,7 13 0 Продолжительность культивирования, ч 46 72 68 72 ВНИИПИ Заказ 4663 Тираж 361 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Предлагаемый способ отличается от прототипа более высоким уровнем образования фенилвлвнина - до 13 г/л (у прототипа 2,88 г/л), более корот" ким сроком ферментации " 46-12 ч (g прототипа 96 ч), на простых по составу средах, содержащих сахаро" sy, источники азота (мочевина или соли аммония), минеральные соли, а 10 в качестве источника ростовых веществ - кукурузный экстракт и трир1 ! тофан, если используемый штамм нуждается в этой аминокислоте. При выделении фенилаланина из ферментацион-15» його раствора выход составляет 60 80X кристаллического продукта. Формула изобретения Способ получения Ь-феннлаланнна, включающий выращивание продуцнрую" ших его штаммов Васд11цэ subtilis в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углеро" пв, азота, минеральные соли и ростовые вещества, до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, о т л и " ч в ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения процесса, в качестве продуцентов используют штаммы ВКПМ В-3549 или ВКПМ В-3550, илн ВКПИ В-3551, или ВКПИ В-3552. Таблица !
