Способ получения рекомбинатной вакцины к гепатиту в

 

(l92 (Н> (51) 5 А б l К 39/29

»»

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Фг

Ф„ ", СОЮЗ СОВЕТСНИК -, . ф.4 --.= СОЦИАЛИСТИЧЕО1ИХ

, (ф. . РЕСПУБ!1ИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 30. 06. 93. Бюл. У 24 (21) 4119880/13

1 (22) 13,08.86 (7l) Институт иммунологии и Институт вирусологии AMi СССР (72) И.В. Красильников, Н.Н. Грановский, В.М. Жданов, P.Â. Петров, Б.,И. Гирдо и И.10. Коткова (56) Maurpber Ь. et al., RNAS, 1985, v 82, рр. 6830-6834. (54) С11ОС05 ПОЛУЧР11И РККОИБИНАНТНОЙ

ВАКЦИНЫ К ГЕПАТИТУ В (57) Изобретение относится к биотехнологии, .а именно, к получению рекомбинантных вакцин к гепатиту В путем микробиологическог синтеза. Пель изобретения — повышение выхода и чистоты целевого продукта. Способ позволяет получать вакцинирующий препарат с выходом 60-67Х с содержанием белков 1ОХ. Штамм дрожжей продуцент

H8sAg культивируют на среде, не содержащей фосфат, разрушают клетки на деэинтеграторе, выделяют и очищают НВзАд путем адсорбционной хроматографии на пористых кремнеземах с элюцией бикарбонатным буфером рН 9,1-9,5 с последующим ультрацентрифугированием в градиенте плотности 50Х-ного раствора тартрата К(йа) и 253-ного раствора глицерина при соотношении компонентов 1: l

1389060

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению рекомбинантных вакцин путем микробиологического синтеза, выделения и обработ" ки антигена для приготовления вакцинного препарата.

Цель изобретения — повышение выхода и чистоты целевого продукта, Пример 1. Получение биомассы дрожжевьгх клеток, содержащих Р,А9. 2-3 крупные колонии дрожжевых ,:леток, штамм ДАН 12/р NNYG 20 (диаметром 3-5 мм}, выросшие на среде I (см. приложение), содержащей 27. агара,, засевают в 200 мл жидкой среды в колбу обьемом 2 л, Культуру инкубиpyroò на качалке при 300-350 об/мин о при 30 С в течение I сут. Концентрация клеток в конце выращивания соста- 20

Ч к: яе ;- 2-6 ° 10 кл./мл. Весь объем

:л льтуры с герильно переносят в 9-10л среры ll, предварительно стерилизо : ной кипячением 0,5 ч в ферментере.

Инкубацию ведут в ферментере с ин- 25

";"åH HâHoé аэрацией при отношении воздуха к среде по объему не меньше

2:l в течение 24-30 ч, при 30 С до концентрации 1,8-2,1 10 кл./мл. Кон7 тронь чистоты культуры проводят мик- 30 роскопированием. Клетки собирают центрнфугированием при 10 000g 15-20 мин при 4 С и замораживают до -20-40 С.

Пример 2. 11олучение полуфаб", риката вакцины. Клеточную массу концентрации 1,8-2,1-10 кл./мл размораживают, ресуспендируют в 100 мл буфера Л (О,OI N NaH P04 0,5 4аС1, рН

7,2-7,4) и подвергают разрушению на деэинтеграторе ФУГ-I при 400- 40

450 об/мин при 4 С (согласно инструкции к ФУГ-.I) в течение 10 мин.

Окончанием процесса дезинтеграции служит достижение разрушения клеток

90Х, контролируемое при микроскопиро- 15 ,ванин. Дезинтеграт клеток центрифугируют при 10-20000xg н 4 С в течение

30-40 мин. Надосадочную жидкость собирают и замораживают при минус 2040 С на 10 ч. Размороженный материал осветляют центрифугированием при

iO-20000xg и 4вС в течение 40 мин.

Титр HBsAg в приготовленном полуфабрикате составляет 20 мкг/мл среды.

Пример 3. Полуфабрикат вакцины готовят аналогично, но время замораживания 18 ч, получают полуфабрикат с титром 30 мкг/мл среды.

П р н м е р 4. Адсорбционная хроматография. К полученному полуфабрикату (280 мл) добавляют макропористое стекло ИПС-2000-ВГХ, предварительно замоченное в воде (объемом стекла

lI0 мл). Суспенэию перемешивают на качалке. в течение 2 ч при 4 С. После того как стекло осядет, в супернатанте определяют содержание HBsAg В надосадке содержится 0,4 мкг/мл внесенного антигена. Затем стекло переносят в колонку и промывают 500 мл

0,05 М фосфатно-солевым буфером. Затем.проводят злюирование антигена, используя 0,05 К бикарбонатный буфер рН 9,1. Скорость элюции составляет

0,2 мл. Антиген элюируется с фронтом бикарбонатного буфера. Полученный концентрат содержит 977 исходной антигенной активности и менее l07. тотального содержания белка.,удельная активность препарата 220 мкг/мл, объем 24 мл.

Пример 5, Для адсорбционной хроматографии используют полуфабрикат, полученный в примере 3, объемом

250 мл, Элюирование проводят бикарбонатным буфером рН 9,5. Получают концентрат с удельной активностью

300 мкг/ил объемом 22 мл.

Выход 807.

Пример 6, Лдсорбционную хро" матографию проводят по примеру 5, Буфер для элюирования имеет рН 9,3.

Получают концентрат с удельной актив" ностью 260 мкг/мл и объемом 25 мл.

Выход HBsAg составляет 807.

Пример 7. Ультрацентрифугиоование в градиенте плотности.

В пробирках обьемом 35 мл готовят градиент плотности, используя в качестве тяжелого раствора 507.-ный калке" во-натриевый тартрат на буфере А, В качестве. легкого раствора используют

257-ный раствор глицерина на буфере А (суммарный объем градиента 20-25 мл).

На градиент соЬтношения компонентов концентрат после адсорбционной хроматографии объемом 12 мл на одну пробирку. Ультрацентрифугирование проводят 14-20 ч при 25 тыс. об./мин на о

SM 27-роторе при 4 С, После ультрацентрифугирования градиент фракционируют, во фракциях определяют содержание HBsAg, объединяют фракции, содержащие более 101 антигена, нанесенного на градиент. Получают б мл пре1389060 парата с удельной активностью

760 мкг/мл.

Выход 85Х, Пример 8. Ультрацентрифуги5 рование осуществляют по примеру 7, используют концентрат по примеру 5.

Получают 8 мл препарата с удельной активностью 800 мкг/мл.

Выход 97,0Х. !

О

П р н м е р 9. Используют концентрат по примеру 6, Ультрацентрифугирование проводят,как в примере 7. Ilo лучают 6 мл препарата с удельной активностью 780 мкг/мл. I5

Выход 70Х.

П р и и е р IO. Приготовление вакцинного препарата осуществляют следующим образом. Объединенную фракцию объемом 6 мл с удельной активностью 760 икг/мл диализуют против буфера А, после диалиэа препарат филь" труют через фильтр с диаметром

0,45 мкл, определяют в нем концентра" цию антигена, получают 8 мп с удельной активностью 550 мкг/мл, разводят физрвстворои до концентрации 15 мкг/мл.

Полученную суспенэию перемешивают периодически в течение 2-18 ч и разли- . вают в ампулы. Получают вакцинный препарат.

Выход антигена 60Х.

Объем серии 280 мл. Содержание

- примесей, по данным злектрофореза, в полиакриламндном геле, составляет около 10Х.

П р и и е р ll. Объединенную фракцию, л по примеру 9, диалнэуют и фильтруют через фильтр диаметром 0,45 мкм, Получают препарат объемом 1О мл, содержащий 600 мкг/мп

HEsAg, В препарат добавляют стерильно гидроокись алюминия до конечной концентрации 1 иг/мл и суспензию разводят стерильно физраствором до 400 мл. 45

Иэ полученного раствора отбирают вликвоты (объемом 25 мл) на анализы, остальное разливают в ампулы. Вакциинвя партия содержит !5 мкг/мл антигенв, количество белковых примесей составляет не более 10%.

Выход внтнгена составляет 67Х от исходного полученного полуФабриката.

Пример !2. Объединенную фракцию, полученную по примеру 10 дивлиэуют, фильтруют и разводят аналогично прииеру II. Получают вакцинную серию, объем которой составляет

300 мп.

Выход антигена 60% от исходного, полученного в полуфабрикате.

Содержание примесей в вакццнном препарате, по данным электрофореза, полнакриламидном геле составляет не более 10%.

Вакцинный препарат (конечный продукт) имеет следующие характеристики: иммунизирующая доза I мл; рН препарата 7,6-7,8; количество белка в дозе— не более 20 мкг/мл; количество HHsAgне менее 5 мкг/мл; содержание прнмесных белков — не более 10% от общего количества белка, содержание гидроокиси А1 - не более 1,2 мг/доза.

Препарат стерилен, неинфекционен, нетоксичен.

Препарат способен индуцировать синтез антител, специфических к

НВэАд, у животных и человека.

Пример 13 Получение рекомбинантной вакцины к гепатиту В из штамма-продуцента дрожжей ДВУ 746 (pNHYG 20) .

Пригбтовление биомассы, разрушение, очистку и получение .готового препарата проводят последовательно по примерам I 2, 4, 7, 10.

Получают вакцинный препарат с выходом 58Х. Объем серии вакцины 95мл, содержание антигена 12 мкг/мл, содержание примесей по данным электрофореза - не более IOX.

Пример 14. Получение реком" бинантчой вакцины к гепатиту В иэ штамма-продуцента дрожжей ДАН 12 (pHHYG 39-54).

Приготовление биомассы, разрушение, очистку.и получение конечного продукта проводят по,примерам 1, 3, 6, 9.

Выход рекомбинантного внтигена составляет 67Х от содержащегося в полуфабрикате.

Партия объемом 375 мл содержит

15 мкг/мл внтнгенв, содержание примесей - не более 10Х.

Пример 15. Данные по синтезу рекомбинвнтного НВэАд в штаммахпродуцентвх дрожжей при культивировании в различных средах приведены в таблице ° J ение

РПГА реда

II

I:4 1:256

1389060

Таким образом, синтез рекомбинантного HBsAg намного выше при использовании для культивирования среды 2.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ получения рекомбинантной вакцины к гепатиту В, включающий культивирование штамма дрожжей продуцента HBsAg на питательной среде, разрушение клеток, выделение и очистку антигена, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, культивирование проводят на бесфосфатной среде, а выделение н очистку проводят, используя адсорбционную хроматографию на пористых кремнеземах, с злюцией бйкарбонатны буфером рН 9,) ° ..9,5 и последующее ультрацентрифугирование в градиенте плотности 50Х-ного раствора тартрата К(йа) и 257-ного раствора глицерина лрн соотношении компонентов 1:I.

Продолжение таблицы

Опыт Штамм-продуцент ч

Определение

HBsAg в РПГА среда среда

I II

1:2 1;128

1:8 1:2048

Приложение

Состав сред культивирования дрожжей и микробиологического синтеза HBsAg (на 1 л.) 1

Компоненты (в r) Среда II

0,9-1,!

Среда !

КС1

КН Ро„

0,9-), 1 ,0,095-0,10

19-21 йаСI

0,095-0,)0

I9-21

0,45-0,55

0,095-0,!05

2,1-2,2

Глюкоза

0,45-0,55

MgS04

СаС1

Аспарагин

0 095-0 105

2,1-2,2

Витамины (в мкr) 190-210

I90-.210

190-2)0

190-210

Тиамин

Рибофлавин

Пнридоксин

Нико тинова кислота

Пара-аминобенэойная кислота 190-210

190-2)0

9-.) I иг

Пантотенат кальция

Ъ

Ипозитол

2. ДВУ 746/рНИУС 20 ) .2 t. ) 28

) I:8 1:)024

2 ДАН 12/рНМУ6 39/541:4 1:2048

Время культивированИя — 24 ч.

Антиген определяли в экстрактах аликвот клеток дрожжей при одинаковых условиях разрушения и экстракции.

190-210

190-2l0

)90-2)0

190-210 !

90-210

)90-2)0

9-1) мг

1389060

1,9-2, I

I 9-2,1

Биотин

Микроэлементы (в мкг) KJ

Н80

Ип50 (КН,),Идо, FeS0

Составитель, В. Адаиуакни

Техред JI.Ñåðäþêîâà Корректор В. Гирияк

Редактор С. Рекова

Производственно-полиграфическое предприятие,.г. Ужгород, ул. Проектная, 4

99- I O I

9,9-10,!

9,9-10,1

9,9-10 l

49-5l

Заказ 2828 Тираа Подписное

ВНИИПИ Государственного «оиитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 ° Москва, й-35, Рауаская наб., д. 4/5

99-101

9,9-10,0

9,9-10,1

9,9-10,1

49-51