Способ окрашивания морского зоопланктона

 

Изобретение относится к гидробиологии и рыбному хозяйству и может быть использовано для оценки продукционных характеристик пелагиали. Целью изобретения является дифференцированное окрашивание живых и мертвых организмов морского планктона. Способ состоит в применении низких концентраций флуоресцентного красителя (акридинового оранжевого) при непродолжительном окрашивании и буферного раствора для его фиксации. 4 табл. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111 (504601 М 21 64 21 91

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

M А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 4117623/31-13 (22) 15.09.86 (46) 07.06.88. Бюп. У 21 (71) Одесское отделение Института биологии южных морей АН УССР (72) Б.Г.Александров и О.А.Аблов (53) 639.29 (088.8) (56) Люминисцентный анализ. /Под ред. M.À.Êoícòàíòèíoâoé-Шлезингер.

N. Изд-во физ.-мат. лит-ры, 1961.

Мельников И.А., Голубова Г.А.

Применение гистохимических красителей для изучения состава взвешенного органического вещества. — В кн.:

Методы исследования органического вещества в океане. M. Наука, 1980, с.206-211.

Wood Е.I.F. Fluorescens microscopy in marine microbiology.

I.Couseil perman. int. exyloraf. шег., 1955, v.21, Р l, р.6-7.

t (54) СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ МОРСКОГО ЗОО"

ПЛАНКТОНА (57) Изобретение относится к гидробиологии и рыбному хозяйству и может быть использовано для оценки продукционных характеристик пелагиали.

Целью изобретения является дифференцированное окрашивание живых и мертвых организмов морского планктона.

Способ состоит в применении низких концентраций флуоресцентного красителя (акридинового оранжевого) при непродолжительном окрашивании и буферного раствора для его фиксации.

4 табл. 1401 360

Т а б л и ц а 1

Наблюдаемый эффект,Продолжительность, мин рН 7,5 рН 7,З

Различие слабое, свечение более интенсивное, но не достаточное для дифференции организмов

Различие между живыми и мертвыми особями слабое., свечение слабое

Различия четкие

Свечение яркое

Различия четкие

Свечение яркое

Различия чеTKue

Свечение яркое

Различия четкие

Свечение яркое

Изобретение относится к гидробиологии и рыбному хозяйству и может быть использовано для оценки продукционных характеристик пелагиали, пространственного распределения орга" ниэмов, выявления районов с различным уровнем загрязнения н т.д.

Цель изобретения состоит в предот" вращении гибели организмов при диффе- 1ð ренцированном окрашивании живых и мертвых организмов.

Поставленная цель достигается тем, что в свежесобранную пробу морского планктона вводится флуоресцент- 15 ный краситель, закрепляется буфером, излишки красителя удаляются промывкой, после чего планктон помещается в фиксирующий раствор. Живые организмы отличаются от мертвых и поврежденных особей количеством накопленногб красителя.

Сущность способа состоит в применении низких концентраций флуоресцентного красителя (акридинового 25 оранжевого) при непродолжительном окрашивании и буферного раствора для его фиксации.

Акридиновый оранжевый вводился в емкость с исследуемыми животными в Эп виде 1,0 -ного раствора на дистиллированной воде (исходный раствор ).

Выбор оптимальной концентрации красителя осуществлялся с использованием наиболее трудноокрашиваемых организмов, в частности личинок балянуса, наиболее эффективное окрашивание достигалось при использовании

0,0001%-ной концентрации с 30-минутной и 0,0002%-ной концентрации с

10-минутной экспоэицией (табл.З). Однако, иэ возможных вариантов сбора полевого материала наиболее удобным является тот, который требует наименьшего времени. Поэтому оптимальным следует считать окрашивание проб зоопланктона 0,0002 .-ным раствором красителя в морской воде при 10-минутной экспозиции. Для предотвращения выхода красителя из организмов, а также для получения более четких различий между живыми и мертвыми особями осуществлен выбор буферной смеси.

Фиксация животных в буфере позволяет улучшить качество прокрашивания организмов, снижая при этом ошибку в определении живых и мертвых особей практически до нуля, а также сохранить яркую флуоресценцию живых организмов в течение месяца при условии хранения их в холодильнике..Наилучший эффект достигнут при ucli пользовании солей калия и натрия фосфорной кислоты (табл.4).

Изменение рН буфера в пределах

7,3 — 7,5 на продолжительность фиксации не влияла. Оптимальной является фиксация в буфере в течение 2 мин (табл.1).

1401360

Продолжение табл.2 рН буфера рН пробы

А Б

6 68

7,20

7,48

7,50

6,74

7,26

7,60

6 94

7,44 рН пробы рН буфера

А Б

Концентрация Время красителя, / экспози ции мин

Число опытов

10

0,0001 10

090001 30

0,00005 30

5 Нет различий

Табgица4

Ф

Наблюдаемый эффект рН смеси

50 Ne, CO 10 мг 8,53 Различий и

3 свечения нет

7,59 Различий нет, свечение слабое

Кроме того, при осуществлении предлагаемого способа обязательным условием является применение 2-4Х-ного раствора нейтрализованного формалина. Невыполнение данного требования приводит к значительному снижению рН среды с исследуемыми животными, что ухудшает окфашивание и снижает продолжительность хранения проб (табл.2). В табл.2 показано изменение рН среды при консервации пробы нейт" рализованным (А) и чистым (Б) 4, HblM раствором формалина.

Таблица 2

7,30 7,16 6,52

0,001

0,0005

0,0005

0,0002

0,0002

В табл. 4 даны реэуль таты применения ра элич ных буферов для фиксации окраски законсервированМорская Буфер вода,мл

Состав Объем, мл

В табл.3 дан процент ошибки (а) при определении различий между живыми и мертвыми личинками балянуса при различных условиях окрашивания акридиновым оранжевым. !

Таблица 3

3 Нет различий

6 9,5+3,5

10 15,6+4,0

19 6,8 290

10 16,8+5,4

5 7 8 3 0

5 0 ных в 47-ном растворе формалина

45 проб планктона со сроком хранения более 2 сут °

1401360

Продолжение табл.4

Наблюдаемый эффект

Морская вода,мл

Буфер рК смеси остав Объем, мл

КН,РО„ (1/15M)

Иа НРО4 (1/15М)

48 СНзСООИа(1N) 7,15 Различия четкие, свечение яркое

Различий нет, 5,14 свечение слабое

СН 3СООН (1N) Анализируются различия между живыми и мертвыми особями при воздействии ультрафиолетового света.

Свечение мертвых животных морского зоопланктона тусклое, равномерное или практически отсутствует.

Формула изобретения

3S

Составитель О,Корженко

Техред И.Дидык

КорректорА.Обручар

Редактор Л.Гратилло

Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Заказ 2780/42

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример. Берут пробу личинок балянуса и проводят следующие опера,ции: окрашивают пробу акридиновым, оранжевым (0,01 мл 1,0%-ного раствора красителя на 50 мл пробы, т.е, концентрация красителя составляет

0,0002%) в течение 10 мин, фиксируют в буфере (1 часть 1/15 М раствора

КН РО + 4 части 1/15 M раствора

N8 ÍÐ04 ) в течение 2 мин, промывают в морской воде 1 мин, переносят пробу в консервирующий раствор (45 мл пробы + 5 мл 4%-ного нейтрализованного формалина + 5 мл буфера).

Непосредственная дифференциация животных может осуществляться под бинокуляром с использованием освети" теля с ртутно-кварцевой лампой и све-! тофильтрами. Живые особи хорошо выделяются благодаря интенсивному зеленому (реже желтоватому) свечению всего тела либо отдельных его частей.

Способ скрашивания морского зоопланктона при исследовании путем введения в пробу красителя - акридинового оранжевого, фиксации в буфере и консервации в 2-4%-ном растворе нейтрализованного формалина, о т л и ч а ю шийся тем, что,. с целью предотвращения гибели организмов при дифференцированном окрашивании живых и мертвых организмов, окрашивание осуществляют 0,0002%-ным раствором красителя в течение 10 мин, фиксацию осуществляют в течение 2 мин при рН буфера 7,3 - 7,5, а консервацию проб осуществляют при рН 7,1

7,2.