Способ выявления каталазной активности в биологических объектах

 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины , в частности к способу выявления активности ферментов. Целью изобретения является упрощение способа выявления каталазной активности. Новым ,является то, что в способе выявления каталазной активности формирования в качестве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламидного геля с добавлением к последнему крахмала, проведения электрофореза и последующего окрашивания йодистым калием крахмал вводят на стадии подготовки раствора надсернокислого аммо . ния для разделя ющего геля, а окрашивание осуществляют с предобработкой в растворе перекиси водорода рН 7,0 и последующей инкубацией в растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания геля в каждом из этих растворов составляет 3-10 мин, а концентрация крахмала в растворе надсер-ч нокислого аммония не должна быть выше 0,5%. Предлагаемьй способ отличается от известного большей надежностью и позволяет выявлять каталазную активность в образцах растительного . и животного происхождения. Последовательное введение ингредиентов в способе позволяет поддерживать целостность полнакриламидного геля, его высокую разрешающую способность и необходигАю рН-градиенты. 3 ил., 2 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН. (51)4 G 01 М 27/2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4182751/31-13 (22) 21 ° 01.87 (46) 07.09.88, Бюп. У 33 (71) Институт ботаники АН КазССР (72) В.И.Романюта, Ф.А.Полимбетова и К.Н.Сарсенбаев (53) 577,15(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

1| 681362, кл. С 01 N 27/26, 1979.

Шадманов Р.К., Никокирис П.Н. Изоферменты амилазы и катализы в хлоропластах .листьев некоторых представителей рода хлопчатников ° Доклады

AH СССР, 1972, т. 207, Р 2, с. 488490. (54) СПОСОБ ВЪ|ЯВЛЕНИЯ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ (57) Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, в частности к способу выявления активности ферментов. Целью изобретения является упрощение способа выявления каталазной активности. Новым ,является то, что в способе выявления каталазной активности цутем формиро„„SU„„1422121 А1 вания в качестве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламидного геля с добавлением к последнему крахмала, проведения электрофореза и последующего окрашивания йодистым калием крахмал вводят на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония для разделяющего геля, а окрашивание осуществляют с .предобработкой в растворе перекиси водорода рН 7,0 и последующей инкубацией в растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания геля в каждом из этих растворов составляет 3-10 мин, а концентрация крахмала в растворе надсер-нокислого аммония не должна быть выше 0,5Х. Предлагаемый способ отличается от известного большей надежностью и позволяет выявлять каталазную активность в образцах растительного . а и животного происхождения. Последовательное введение ингредиентов в способе позволяет поддерживать целостность полиакриламидного геля, его высокую разрешающую способность и необходим*|е рН-градиенты. 3 ил., 2 табл.

1422121

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине.

Целью изобретения является упрощение способа выявления каталазной ак5 тивности °

Способ выявления каталазной активности предусматривает формирование в качестве поддерживающеи среды для электрофореза полиакриламидного геля с добавлением к последнему крахмала, проведение щелочного электрофореэа

И последующее окрашивание йодистым калием, крахмал вводят на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония для разделяющего геля, а окрашивание осуществляют с предобработкой в растворе перекиси водорода

РН 7,0 и последующей инкубацией в растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания геля в каждом из этих растворов составляет 3-10 мин, а концентрация крахмала в растворе надсернокислого аммония не должна быть выше. 0,57. Предлагаемое исполь- 25 зование крахмала не изменяет градиенты РН в системе, подготовленной для электрофореза, а следовательно, разрешающую способность полиакриламидного геля. Введение крахмала на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония для разделяющего геля создает оптимальные режимы для дегазации раствора и распределения крахмальных частиц в нем, что облегчает окрашивание фермента. Последующее

35 выявление ферментативной активности

Йодистым калием достигают предварительной обработкой в 17-ном растворе перекиси водорода РН 7,0. и инкубаци- 40 ей в 1К-ном растворе уксусной кислоты. Данную РН раствора перекиси водорода поддерживают соответствующей ,цля фермента буферной системой.

При осуществлении способа все one-. „5 рации выполняются в определенной последовательности. Сначала приготавливают электродный буфер и рабочие растворы для формирования геля. При приготовлении раствора надсернокислого

50 аммония вводят крахмальный золь. При этом концентрация крахмала в растворе надсернокислого аммония составляет

0,57. Полимеризацию геля осуществляют в кварцевых или стеклянных трубках.

Далее на торцовую поверхность геля наносят ферментную пробу. Электрофорез ведут в щелочной системе при постоянных РН, температуре и подаче нап1 н. НС1 трис-Гидромексилметил аминометан

48 мл

36,6 r

Ряжения к электродному буферу. По окончании электрофореза. гели освобождают от электрофоретических трубок и. снижая. РН геля, осуществляют процедуру окрашивания. При этом гели вначале инкубируют 3-10 мин в растворе перекиси водорода, затем в растворе уксусной кислоты в течение такого же времени и далее обрабатывают раствором йодистого калия.

Введение крахмала на стадии приготовления раствора надсернокислого аммония для разделяющего геля в предлагаемом способе имеет также преимущество по сравнению с известным в связи с тем, что небольшая навеска катализатора фотополимеризации (т.е. персульфата) по сравнению с навесками ингредиентов, входящих в остальные растворы, н частности А,ц и В, облегчает формирование геля и повышает er o целостность. Введение крахмала на конечной. стадии формирования геля делает способ надежным. Кроме того, приготовление раствора метиленбисакриламида требует повышения температурных режимов по сравнению с та ковыми при образовании крахмального золя.

На фиг.1 показана схема электрофореграмм образцов после выявления их на каталазную активность, где 1 каталазная активность печени быка, 2 — каталазная активность листьев яровой пшеницы Саратовская-29; 3 каталазная активность листьев озимой пшеницы Мироновская-808; 4 — каталазная активность пероксидазы хрена;

ОЗП вЂ относительная электрофоретическая подвижность; на фиг ° 2 — схема электрофореграмм зерна пшеницы, где

1 — яровой, 2 вЂ, озимой, ОЭП вЂ” относительная электрофоретическая подвижность; на фиг.3 — схема РН-значений системы для электрофореза, где 1 электродный буфер, 2 — концентрирующий- гель, 3 — разделяющий гель.

Пример 1. Выявление каталазной активности печени быка осуществляют следующим образом, Сначала формируют полиакриламидный гель. Для этого приготавливают запасные водные растворы. По щелочной системе они следующего состава:

Л„

1422121

N, N, N, N --тетраметил-этиле ндиамин (ТЕМЕЛ)

Вода

0,23 мл

Остальное (до 100 мл) 48 мл

5,98 r 1p

0,46 мл

Остальное (до 100 мп) в,„

Акриламид

Метиленбисакриламид

Вода

28 r 15

0,735 г

Остальное (до 100 мл) I ww

Акриламид

10 г 20

2,5 r

Ос т аль ное (до 100 мп) Ме тиле н бис акр ил амид

Вода

4 мг

Остальное (до 100 мл) Рибофлавин

Вода

Е ч

Сахароза

Вода

8gg

1 н. НС1 трис-Гидроксилметил)— аминометан

ТЕМЕД

Вода

40 r

Остальное (до 100 мл)

Аммоний надсернокислый 140 г

Крахмальный золь Остальное (до 100 мл) 35 . Раствор, содержащий надсернокислый аммоний и крахмал, приготавливают только в день его использования. При этом сначала при температуре выше 4П

70 С получают из крахмала жидкий золь.. Используют картофельный растворимый крахмал для .йодометрии. Концентрация его в растворе персульфата не должна быть выше 0,5Х. После охлажде - 45 ния крахмального золя до 25-27 С в него вносят надсернокиелый аммоний и тщательно перемешивают. Разделяющий гель формируют путем смешивания исходных растворов А, В, 2 в соотношении 1:2:4 соответственно, после чего добавляют 1 ч. воды и проводят дегазацию с помощью вакуумного насоса. Затем смесь помещают в электрофоретические трубки (кварцевые или : 55 стеклянные), устанавливают на горизонтальные подложки. Диаметр трубок

5 мм, длина 100 мм. Во всех трубках поддерживают строго горизонтальный уровень жидкости. Для этого на торцовую часть трубок с помощью медицинского шприца типа "Рекорд" на 2 мл осторожно наслаивают 0,3 мм бйдистил° лированной воды. Полимеризуют гели в темноте при 35 С. По окончании этой стадии осуществляют осушивание гелевой поверхности узкими полосками, фильтровальной бумаги, после чего на".. слаивают слой концентрирующего геля.

Концентрирующий гель образуют из растворов Б, Г, Д, Е в соотношении

1:2:1:4 соответственно. Устанавливают уровень концентрирующего геля так же, как. и в случае разделяющего. Полимеризацию осуществляют при комнатной температуре в условиях дневного света или подсветки. Далее наносят ферментную пробу (3 мМ) каталазы печени быка в количестве 35 мкл на трубку с rpaдиентом сахарозы и начинают электрофорез. В качестве электродного буфера служит трис-глициновый рН 8,3, который перед употреблением разбавляют в 10 раз ° Исходный его раствор составляют следующим образом: трис-Гидроксилметиламинометан 6,0 r

Глицин 28,8 г

Вода Остальное (до 1000 мп)

Электродный буфер должен. быть охлажденным до 8-10 С. Электрофоретическое разделение ферментного препарата ведут в услоррях указанной температуры. Подача тока на трубку соответствует 2,7 мА. В качестве источника тока служит УИП-1. Время электрофореза 2 + 0,3 ч. По окончании этого процесса гели освобождают из трубок под давлением жидкости, в качестве которой применяют электродный буфер, подаваемый из медицинского шприца типа "Рекорд" на 20 мл. 3а период электрофореза устанавливают пробирки в штативе и заполняют их 1Хным раствором перекиси водорода рН 7,0 (субстрат для фермента) . Данную рН поддерживают с помощью буферной системы, например, приготавливают субстрат на 0,01-0,05 М фосфатном буфере рН 7,0. Использование указанного точечного значения рН диктуется следующими условиями: использование раствора перекиси водорода с рН выше

7,0 не приводит к оптимальному эакислению гелей, в то же время понижение рН вызывает ломкость геля. Процесс

5 14221 ведут при комнатной температуре, высвобожденные из электрофоретических трубок гели помещают в .пробирки, содержащие перекись водорода и инкуби5 руют в течение 5 мин, после чего отделяют жидкость путем ее слива. При этом время инкубации в субстрате, а также последующие операции выдерживают строго по отношению к каждому варианту. Окрашивание гелей осуществляют. обычным путем, применяя 1%-ный раствор йодистого калия, подкисленйый разбавленной уксусной кислотой известным. способом. 15

Пример 2. Способ выявления каталазной активности осуществляют по примеру 1, но выявляют каталазную активность листьев яровой пшеницы.

Пример 3 . Способ выявления 2п хаталазной активности проводят по примеру 1, но выявляют каталазную активность листьев озимой пшеницы.

Пример 4, Осуществление способа аналогично примерам 1-3, однако 25 .Выявляют каталазную активность пероксидазы хрена.

Пример 5. Способ выявления каталазной активности осуществляют

rlo примерам 1-4, но в отношении ката- 0

Лазы зерна яровой пшеницы.

Результаты выявления ферментатив-. ной активности согласно примерам 1-4

k схематически представлены на фиг. 1.

Сравнение схемы электрофореграмм ка35 талазы печени быка, листьев яровой и озимой пшеницы, а также пероксидазы хрена позволяет установить видовые различия по каталазной активности.

Т а б л и ц а 1

Способ

Этапы способа предлагаемый известный

8, 9- 9, 0

9,4-9,5

8,9-9,2

8,0-8,2

7,4-7,8

Нет инкубации, т.е. рН остается

8,0-8,2

7,2-7,3 рН разделяющего геля,при

его формировании рН разделяющего геля после электрофореза рН геля после инкубации

его в растворе перекиси водорода рН 7,0 рН геля после инкубации

его в растворе уксусной кислоты

21 6

Пример 6. Способ проводят по примерам 1-5, но выявляют каталазную активность зерна озимой пшеницы.

Схема электрофореграмм (фиг.2) представлена согласно примерам 5 и 6.

Предлагаемый способ (фиг.1 и 2) дает возможность выявить каталазную активность в различных объектах растительного и животного происхождения.

На фиг.3 дана схема значений рНсистемы, подготовленной к электрофорезу. По предлагаемому способу введение крахмала концентрацией меньше

0,5% в момент подготовки надсернокислого аммония позволяет сохранить такую схему. Увеличение концентрации крахмала выше 0,5% приводит к экранированию пор полиакриламидного геля и уменьшению его разрешающей способности.

Надежность способа поддерживают и предварительной обработкой геля в растворе перекиси водорода рН 7,0 и последующей инкубацией в растворе уксусной кислоты. Формирование геля и проведение электрофореза осуществляют при различных локальных значениях рН-системы. Однако для контакта фермента с субстратом и проведения ферментативной реакции необходим оптимум рН. Поэтому инкубация геля сначала в субстрате, а затем в растворе,, содержащем уксусную кислоту, и послеh дующее окрашивание подкисленным раствором йодистого калия отвечают такому требованию. В табл. I представлены значения рН в процессе выявления каталазной активности.

1422

Эффект

Время инкубации в 1Х.-ном растворе уксусной кислоты, мин

Активности нет

3 зоны

Четкое выявление каталазной активности (до 4-5 зон)

3-4 зоны

10

Зоны размыты, слабая активность

При обработке геля раствором перекиси водорода, а затем уксусной кислотой в предлагаемом способе выдерживают временные режимы. Временной режим менее чем .3 мин недостаточен для пропитки геля субстратом, наблюдают эффект "краевого окрашивания" (как в известном способе). Увеличение времени более чем 10 мин неэко- 10 номично, поскольку насыщение субстратом геля происходит раньше. Кроме того, дальнейшее выдерживание геля в растворе, содержащем уксусную кислоту, влияет на качество окрашивания йодистым калием, В табл. 2 представлен эффект выявления каталазной активности в соответствии с временным режимом инкубации в растворе уксусной кислоты. 20

Таблица2

121 8.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что он дает возможность выявлять каталазную активность в вытяжке, экстрагируемой из органов и тканей, различающихся как по происхождению, так и по функциям. Это достигается последовательным введенйем

"ингредиентов в способе, что позволяет поддерживать целостность геля, его высокую разрешающую способность. Способ можно применять при исследовании объектов растительного и животного происхождения.

Фо р мул а и з о бр е те ния

Способ выявления каталазной активности в биологических объектах, предусматривающий формирование в каче-. стве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламидного геля с использованием крахмала, проведение щелочного электрофореэа исследуемого образца и последующее окрашивание геля иодистым калием, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения процесса, крахмал вводят в количестве, не превышающем 0 5 мас.Х на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония при приготовлении разделяющего геля, а окрашивание осуществляют обработкой в 1Х-ном растворе перекиси водорода рН 7,0 с последующей инкубацией в 1Х-ном растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания в каждом из этих растворов устанавливают 3-10 мин. г

ОЮ

ОЛ

Ю/7 1

РР

-Р,50

Р,Л

+1,О,ЮЛ

-Р,ОР

+7,Ю

1 к 1