Среда для активации трансглутаминазы

 

Изобретение относится к биохи-; мин, в частности к энзимологии, и может быть использовано в научных исследованиях, связанных с определением активности трансглутаминазы в биологических объектах, в клинической биoxи ши при диагностике нарушенийсвертьшания крови, в пищевой промьшшенности для улучшения качества белковых заменителей натуральных мясных продуктов. С целью повышения степени активации фермента трансглутаминазы в среду известного состава, содержащего хлорид кальция, дитиотреитол, буфер трис-НС1, воду, дополнительно вводят бикарбонатньБ буфер (НСО + СО) при следующем соотношении компонентов, мас.%: хлорид кальция 0,020-0,100 дитиотреитол 0,050- 0,080, буфер трис-НС 0,60-1,200; « бикарбонатный буфер Х( СО) 0,018-0,180; вода - остальное. Использование бикарбонатного буфера позволяет повысить удельную активность трансглутаминазы в 2,5-8,7 раз.В 2 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 9/10 13/ОО (° ю

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4215127/31-13 (22) 12. 01. 87 (46) 23. 12.88. Бюл. 947 (71) Институт биохимии им. А.В.Палладина (72) В.О.Иихайловский и Н.И.Мироненко (53) 577.15 (088.8) (56) Lorand L., Campbell Milhes, (;ooperstein L. А filter paper assay

for transamidating enzymes using

radioactive amine substrates. — Anal.

Biochem. 1972, 50, N 2, р; 623-631.

Folk J,Å. Annu. Pev. Biochem, Transglutaminases. 1980, 49, 517-531. (54) СРЕДА ДЛЯ АКТИВАЦИИ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЫ (57) Изобретение относится к биохи- ; мии, в частности к энзимологии, и может бьггь использовано в научных исследованиях, связанных с определе„„SU„„1446158 А 1 нием активности трансглутаминазы в биологических объектах, в клинической биохимии при диагностике нарушений свертывания крови, в пищевой про- мышленности для улучшения качества белковых заменителей натуральных мясных продуктов. С целью повышения степени активации фермента трансглутаминазы в среду известного состава, содержащего хлорид кальция, дитиотреитол, буфер трис-НС1, воду, дополнительно вводят бикарбонатный буфер (НСО + СО ) при следующем соотношез нии компонентов, мас.Х: хлорид кальция 0,020-0,100 дитиотреитол 0,0500,080, буфер трис-НС1 0,60-1,200; щ бикарбонатный буфер Х(НСО + СО )

0,018-0,180; вода — остальное. Использование бикарбонатного буфера ( позволяет повысить удельную активность трансглутаминазы в 2,5-8,7 раз. »

2 табл.

144о 158

Изобретение относится к биотехнологии.

Целью изобретения является повышение степени активации трансглутамина5 зы.

Благодаря введению в состав среды бикарбонатного буфера скорость реакции образования внутри — и межмолекулярных изопептидных связей между остатками глутамина белка и аминогруппами низкомолекулярных лигандов значительно возрастает, что и определяет повьппение степени активации фермента в 2,5-8,7 раз.

П .р и м е р. В 1,0 И буферном растворе трис-НС1, рН 7,0 последовательно растворяют 1,0 г хлорида каль ция и 0,8 г дитиотреитола и объем доводят растворителем до 100 мл (состав 1). В бидистиллированной воде растворяют 1,21 г бикарбоната натрия, объем доводят до 100 мл и через раствор под контролем ионометра пропускают углекислый газ до рН 25

7,0 (состав 2), причем, суммарное количество углекислоты рассчитывают.

Затем составы 1 и 2 объединяют в следующем соотношении, об. ч:

Состав 1 1„0

Состав 2, 2,ã

Вода 7,8

Полученная среда для активации трансглутаминазы содержит указанные компоненты состава в следующих кон

35 центрациях, мас.Ж:

Хлорид кальция О, 100

Дитиотреитол 0,080

Буфер трис-НС1 1. 200

Бикарбонатный

40 буфер (НСОэ + СО>) рН 7,0 О, 180

Составы среды представлены в табл. 1.

Активация трансглутаминазы. В пробирку последовательно вносят субстраты реакции (путресцин и казеин), среду состава 5, а еатем фермент, выделенный иэ печени крыс. Реакцию осуществляют при 37 »С в течение

5 мин. О степени активации судят по

50 увеличению скорости ферментативного процесса в сравнении с образцами, не содержащими в составе среды бикарбонатный буфер. Активность трансглутаминазы, инкубируемой в среде .иэвест

55 ного состава, составляет 110 усл. ед. (1 усл. ед. акт. — 1 пкмоль путресцина, связавшегося с казеином, на 1 мг белка фермента за 1 MHH)» активность трансглутаминазы в полученной среде

375 усл. ед.

Эффективность активирующего действия среды доказана результатами экспериментов, представленными в табл. 2.

Как видно из данных табл. 1 и 2, введение углекислоты в количествах меньше 0,018Х (состав 1 (НСО + СО )=

= 0»004%) не влияет или незначительно влияет на повышение активности фермента. Увеличение содержания углекислоты (вьпае О, 18%) не обеспечивает дальнейшего повышения уровня активности (состав 6: (НСО з + СО )

= 0,264%) и не оправдывает дополнительного расхода реагентов.

Увеличение ферментативной актив". ности трансглутаминаэы в 2,5-8;7 раз благодаря использованию среды обеспечивает оптимальные условия приме. нения фермента для обработки белковых заменителей натуральных мясных продуктов, а также активацию фермен- ., та ири необходимости в физиологических условиях (максимальная активность проявляется при рН 7,0-7,4), Использование предлагаемой среды для осуществления трансглутаминаэной реакции в клинической и научноисследовательской практике позволит повысить эффективность проводимых исследований за счет сокращения времени их проведения, уменьшения расхода реактивов.

Формула изобретения

Среда для активации трансглутаминазы, содержащая хлорид кальция, дитиотреитол, буфер трис-НС1, бидистиллированную воду, о т л и ч а.ю щ а яс я тем, что, с целью повьппения степени активации, она дополнительно содержит бикарбонатный буфер (НСО + СО ), рН 7,0-7,4 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Хлорид кальция О, 020-0, 100

Дитиотреитол О, 050-0, 080

Буфер трис-НС1 О, 600-1, ?00

Бикарбонатный буфер (НСО +СО )» рН 7,0-7,4 0,0 18-0, 180

Вода бидистиллированная Остальное

1446158

Та блица 1

Содержание; мас. X в составе

Ингредиенты среды

) 1 1

О, 020 О, 060 О, 100 О, 100

0,050 0,070 0,080 0,080

0,060 0,100 0,200

1, 200

0,009 0,018

0,044 0,180 0,264

Бикарбонатный буфер (HCO3 + CO ) До 100 До 100 До 100 До 100 До 100 До 100

Вода

Таблица 2

Показатели

Состав среды

1 1 1 I рН (6

3 4 5

1 2

Активность фермента, усл. ед. 414,0 523,6 745,0 927,0 1160,0 1123,0 7,4

111,6 153,7 376,0 738,0 975,0 967,0 7,0

26 80

139 240

Повышение актив- О ности в сравнении с прототипом, Е 0

124

180 1?1 74

571

780 774

7,0

Составитель А.Семенов

Техред JI.Олиинык

Корректор А, Обручар

Редактор Г.Гунько

Подписное

Заказ 6706/30

Тираж 520.ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, тная 4

Хлорид кальция

Дитиотреитол

Буфер трис-НС1

О, 020

0,050

0,060

0,004

0,020

0,050

0,060