Способ получения l-лизин- @ -оксидазы

 

Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и науч- . ных исследованиях. Целью изобретения является повьшение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ заключается в следующем. После культивирования Trichodermai hazzia- num Rifai отделяют культуральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммония (35% насыщения ) , центрифугируют и проводят хроматографии на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме и аффинном сорбенте лизин-сефарозе СЬ4Б, а полученный ферментный раствор насыщают сульфатом аммония i с (О

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111 (51) 4 С 12 N 1/14 9/06

И("ПЕГИМ (l

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4302540/28-13 (22) 16.07.87 (46) 30. 0.1 . 89. Бюл. N - 4 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) H. Б. Янкевич, С. П. Пуоджюте, Н.Ф. Лаугалене, В,С ° Веса, И.И. Песлякас, О.Ф. Суджювене, В.А. Тиминскене, С.Х. Хадуев и Т.Т. Березов (53) 663.15(088.8) (56) Кцза1саЬе Н., Kodama R Kumnaka А., Joshino Н., Nisono И., Soda К, — J. Biol. Chem. 1980, v. 255, Р 3, р. 967-:981.

Хадуев С. Х., Лукашева E. В.

Смирнова И. П., Березов Т ° Т. — Вопросы медицинской химии, 1985, т. 31, вып. 5, с. 130-134, Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и научных исследованиях. 5

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Способ заключается в следующем.

После культивирования Trichoder . 10 ша hazzianum Rifai отделяют культу" ральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммония. (35K насьпцения), центрифугируют и проводят хроматографию на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а затем диализованные фракции фермента (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ЛИЗИН-a(-ОКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и научных исследованиях. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ заключается в следующем, После культивирования Trichoderma(hazzianum Rifai отделяют культуральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммония (35X насыщения), центрифугируют и проводят хроматографии на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме и аффинном сорбенте лизин-сефарозе СЬ4Б, а полученный ферментный раствор насыщают сульфатом аммония.

Фв4

4ъ наносят на колонку с аффинным сорбентом лизин-сефарозой CL4B и элюи- р руют фермент линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 1 и, причем обе хроматографии проводятся при рН 5,5-7,4, а полученный фермент- Ж ный раствор насыщают сульфатом аммония.

Использованный бутилсилохромовый сорбент содержит в качестве специфических лигандов бутиловые радикалы, обеспечивающие специфическое гидрофобное взаимодействие их с лизиноксидазой.

Ь вЂ Лиз-сефароза CL4B относится к биоспецифическому сорбенту по отношению к ферменту. з 145

Сорбенты с выбранными структурами обладают необходимыми свойствами, которые позволяют достичь поставленную цель, т.е. освободиться от сопутствующих ферменту примесей и получить его с 56,0 .-ным выходом, Пример 1. Способ получения высокоочищенной Ь-лизин- 4 -оксидазы.

Получение сорбента бутилсилохрома 500/80, Получение бутилглицидилового эфира.

В колбу вместимостью 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром, капельной воронкой и обратным холодильником, вводят 456,8 мл н-бутанола и 20 мл BF (С Н ) 0. Температуру смеси поднимают до 55 С и при перемешивании вводят по каплям в течение 4 ч 395 мл эпихлоргидрина.

Смесь оставляют на 14 ч, после «tera при перемешивании при ?О-25 С вводят по каплям 250 мл 50 .-ного раствора

Na0H. Выделившийся эфир отделяют, промывают четырьмя порциями дистиллированной воды и продукт высушивают над безводным ITgS0 . Эфир фильтру;от и перегоняют в вакууме при 57-63 С/

/19 мм рт. ст, Получение бутилсилохрома 500/80, В колбу вместимостью 500 мл, снабженную механической мешалкой, термометром и обратным холодильником, вносят 100 г силохрома эпоксидного

500/80 (ТУ 6-09-10-1618-84), добавляют 350 мл абсолютного диоксана, 10 мл бутилглицидилового эфира и при перемешивании,суспензии вводят по каплям 7 мл бора трехфтористого эфирата. Суспензию перемешивают в течение 5-10 мин при комнатной температуре, после чего температуру о поднимают до 90 С и смесь перемешивают 2 ч при 90 С. Полученный сорбент отфильтровывают, промывают диок", саном, этанолом, pHcTHJIJIHpoBaHHoH водой, ацетоном и высушивают при

60-70 С в течение 24 ч. Концентрация остатков бутила в сорбенте составляет 80 мкмоль/г.

Получение сорбента лизин"сефарозы СЬ4В.

28 мл сефарозы CL4B заливают

26,4 мл 1 N натриевой щелочи и вводят при перемешивании по каплям в течение 15 мин 5,6 мл эпихлоргидрина.

Суспензяо перемешивают еще 1 ч при б комнатной температура и 1 ч при 60 С.

4846 4

5

Затем отмыва ат 6 раз чередованием по 30 мл водой и этанолом ° После чего эноксидированную сефарозу заливают раствором, полученным следующим образом.. 3,1 г хлоргидрата лизина растворяют в 20 мл дистиллированной воды, прибавляют 9,3 г основной углекислой меди, перемешивают 15 мин при 80 С, о фильтруют и осадок промыва от 5 мл дистиллированной воды, рН фильтрата доводят до 9,9, добавля от карбонат натрия до концентрации 1 IT. Полученную суспензию перемешива ат 4 ч при

80 С, фильтруют и осадок промыва от о последовательно 400 мл дистиллированной воды, 500 мл 0,1 И ЭДТА, 300 мл воды, 500 мл 0,1 М карбонатом натрия и 400 мл воды, Получение бесклеточной культуральной жидкости, содержащей Ь-лизин-4 —-оксидазу.

Продуцент лизиноксидазы Trichoderma hazzianum ЫЕа культивируют глубинным способом на питательной среде следующего состава„ г/л: 50 пшеничных отрубей и 50 NH4N0, при

28 С на качалке в течение 6 сут. о

Клетки микроорганизмов и твсрдые осадки отделя ат центрифугированием при 3000 об/мин в течение 0,5 ч.

В центрифугате определяют удельную

L-лизин-<(-оксидазную активность, которая составляет 1,07 Е/мг белка (11/О мл).

Осах<дение пр«помесей аммоний сульфатом, В бесклеточную культуральную жидкость в объеме 1170 мл (рН 7,1) с удельной активностью 1,28 Е/мг белка при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 мин добавляют аммоний сульфат марки х.ч. (244,5 r) до 35 насыщения, Перемешивание продолжают еще 1 ч, затем выпавший оса» док центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 ч. Осадок отбрасывают, а супернатант объемом 1250 мл (содержание белка 2012 мг, лизиноксидазная активность 2585 ед) наносят на колонку с сорбентом бутилсилохром 500/80.

Хроматография ферментного раствора на сорбенте бутилсилохром 500/80. о

Хроматографию проводят при 4 С.

Стеклянную колонку размером 50х70 мм заполняют 100 r бутилсилохрома (конц. лиганда 80 мкМ/r), уравновешивают тремя объемами (350 мл) 0,02 М натрий фосфатного буфера (ph 6,6). За46 6 обладающего лизиноксидазной ферментативной активностью, отбрасывают, а последующий элюат в количестве 72 мл собирают, определяют L-лизин- К -оксидазную активность и содержание белка, насыщают до 35 аммоний сульфатом и хранят. Удельная лизиноксидазная активность составляет 27,0 E/Mã, выход по активности на этой стадии хроматографии равен 95 . Общий выход от начальной активности в культуральной среде по примеру 1 составляет 51.8 .

Пример 2. Способ получения высокоочищенной -лизин- 4 --оксидаэы проводят аналогично примеру 1, только хроматографию L-лизин- c(-оксидазы на сорбенте бутилсилохроме проводят при рН 7,4. Полу-чают фермент с выходом 56,0, с удельной активностью целевого продукта 31,5 Е/мг белка.

Пример 3. Способ получения высокоочищенной 1.-лизин-k -оксидазы проводят аналогично примеру 1, толь- . ко хроматографию L-лизин- К-оксидазына сорбенте бутилсилохроме проводят при рН 5,5. Получают фермент с выходом 49,2, с удельной активностью

26,5 Е/мг белка.

14548

Способ получения L-лизин- -оксидазы из культуральной жидкости гриба

Tr.ichoderma hazzianum Rifai, включающий осаждение примесей фермента . сульфатом аммония с последующим проведением двухэтапной очистки путем хроматографии с получением целевых фракций элюата и последующим осаждением последнего сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода целевого продукта и упрощения способа, на первом этапе хроматографию проводят на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а на втором — ведут аффинную хроматографию на лизин-сефарозе CL4B и на обоих этапах рН устанавливают 5,57,4, при этом перед проведением аф- финной хроматографии осуществляют дополнительную очистку элюата диализом, а осаждение после аффинной хроматографии проводят сульфатом аммония 35 насыщения.

50 тем наносят на так подготовленную, колонку с сорбентом со скоростью

200 мл/ч с помощью перистальтического насоса 1250 мл ферментного раствора в 1 M аммсний сульфате (35 o

5 на сыщения) .

1(олонку промывают 420 мп 1 M раствора аммопий сульфата в 0,02 М натрий фосфатпом буфере в течение 7 ч (скорость тока 60 мл/ч), При этом отмываются примеси, которые отбрасывают. Затем переключают насос на исходный 0,02 M натрий фосфатный буфер и элюированне продолжают со скоростью 25 мл/ч. Порцию элюата объемом

130 мл, не обладающего ферментативной активносгью, отбрасывают, а последующие фракции объемом 240 мл собирают, определяют лизиноксидазную активность и белок, которые равны

1913 ед. и 218 мг соответственно, что отвечает удельной активности

8,77 Е/мг белка, выход по активности на этой стадии 74 ..

Диализ.

Элюат объемом 240 мл (уд, акт.

8,77 Е/мг) диализируют против 0,01 И универсального буфера (УБ), состоящего из равных vo объему 0,01 И ук- З0 сусной, борной и ортофосфорной кислот (pH 7,4), при 4 С в течение 20 ч и наносят на L — ëèçèí-сефарозу CL4B, уравновешенную 0,02 M универсальным буфером, рН 7,4, Хроматография ферментного раствора на сорбенте L-лизин-сефарозе CL4B. о

Хроматографию проводят при 4 С.

Стеклянную колонку размером 25х140 мм заполняют 100 мл (25 г сухого вещест- 40 ва) набухшего сорбента L-лизин-сефарозы CL43, уравновешивают 200 мл

0,01 M универсального буфера, рН 6,6.

Затем наносят на так подготовленную колонку со скоростью 24 мл/ч 240 мл 4 диализата (210 мг белка, 2034 ед. лизиноксидазной активности). Исходным буфером (тот ые уравновешивающий} объемом 420 мл со скоростью 24 мл/ч вьмыва т примеси. и отбрасывают. Затем исходный буфер заменяют на градиент равных по объему(исходный бу;,i фер — 1 М раствор натрия хлористого) и элюирование продолжают с той же скоростью. Порцию 120 мл элюата, не

55.

Формула изобретения