Способ контроля генетической однородности мышей инбредных линий
Изобретение относится к биологии и может быть использовано для генетического контроля количества инбредных животных. Целью изобретения -является упрощение способа. На инбредных мышах с каждым конкретным гаплотипом Н-2 индивидуально получают полиспецифические аллоиммунные сыворотки против антигенов других гаплотипов Н-2, что позволяет при проверке на гомозиготность инбредных мышей, имеющих определенный гаплотип Н-2, использовать панель сывороток, полученных на мышах с этим гаплотипом , а тестирование животных проводить с применением метода гемагглютинации . Если тестируемые инбредные мыши имеют стандартный гаплотип Н-2, серологическая реакция будет отрицательная . В случае контаминации мьш1ей исследуемой линии одна из сывороток панели даст положительную реакцию. 4 табл. а (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (19) (11) А1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 424301 2/28-13 (22) 30.03 ° 87 (46) 15.02.89. Бюл. )i - 6 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AMH СССР (72) Н.Н. Клепиков, Л.С. Павлова, Л.Я. Шевякова и С.А. Хрусталев (53) 575.148(088.8) (56) Дж, Снелл,.Ж. Доссе, С, Нэтепсон. Совместимость тканей, M.: Мир, 1979, с. 498. (54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ОДНОРОДНОСТИ МИНЕИ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ (57) Изобретение относится к биологии и может быть использовано для генетического контроля количества инбредных животных. Целью изобретения является упрощение способа. На
ИзоЬретение относится к биологии и может Ьыть использовано для генетического контроля качества инбредных живо тных, Цель изобретения — упрощение спо-. соба.
На инЬредных мышах с каждым конкретным гаплотипом Н-2 индивидуально получают полиспецифические аллоиммунные сыворотки против антигенов других гаплотипов Н-2, что позволяет при проверке на гомозиготность инбредных мышей, имеющих определенный гаплотип Н-2, использовать панель сывороток, полученных на мышах с этим гаплотипом, а тестирование животных .проводить с применением только метода гемагглютинации. Если тестируемые (5ц 4 G 01 N 33 50 С 12 N 15 00 инбредных мышах с каждым конкретным гаплотипом Н-2 индивидуально получают полиспецифические аллоиммунные сыворотки против антигенов других гаплотипов Н-2, что позволяет при проверке на гомозиготность инбредных мышей, имеющих определенный гаплотип
Н-2, использовать панель сывороток, пОлученных на мышах с этим гаплотипом, а тестирование животных проводить с применением метода гемагглютинации. Если тестируемые инбредные мыши имеют стандартный гаплотип Н-2, серологическая реакция будет отрицательная, В случае контаминации мышей исследуемой линии одна из сывороток панели даст положительную реакцию.
4 табл. инбредные мыши имеют стандартный гапло тип Н-2, серологическая реакция отрицательная, При контаминации мышей исследуемой линии одна из сывороток панели дает положительную реакцию. В случае получения полиспецифических аллоиммунных сывороток против Н-2 антигенев на мышах конгеннорезистентных линий, контроль генетической однородности инбредных мьппей можно осуществлять как с помощью реакции гемагглвтинации, так и с помощью цитотоксического теста. Полученные полиспецифические аллоиммунные сыворотки могут быть использова. ны как с применением известного метода гемагглютинации в пробирках, так и с применением предлагаемого
14588
35 метода в микрокамере для иммунологических реакций.
Пример 1. Проверка активности полученных полиспецифических аллоан5 тисывороток с применением известного метода гемагглютинации (макрометод в пробирках). От тестируемых животных получают кровь из ретроорбитального синуса, выделяют и отмывают 10 эритроциты и готовят их 2%-ную суспензию на фосфатно-солевом буфере рН 7,4. В пробирки для гемагглютинации раскапывают по 100 мкл полученных аллоантисывороток, разведенных 15 в фосфатно-соленом буфере рН 7,4, содержащем 1% поливинилпирролидона и 0,1% бычьего сывороточного альбу.мина. Затем к иммунным сывороткам добавляют по 50 мкл 2%-ной суспензии тестируемых эритроцитов, Инкубируют при комнатной температуре 1,5 ч, центрифугируют 30 с, добавляют в каждую пробирку 0 5 мл физиологического раствора и с помощью пастеровой пи- 25 петки смывают эритроцитарную бляшку, учитывая таким образом силу реакции.
Полученные результаты с использованием известного метода представлены в табл. 1. 30
Из табл. 1 видно, что каждая полиспецифическая аллоиммунная сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена. Так, эритроциты мышей линии С57В1/10, имеющих генотип Н-2 /Н-2 дают поло. 5 b жительную реакцию с иммунной сывороткой анти-H-2 ; эритроциты мышей линии
ВА18/с, имеющих генотип Н-2 /Н-2 ., d d дают положительную реакцию с иммун- 40 ной сывороткой анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии СВА, имеющих генотип
Н-2 /Н-2, дают положительную реакцию . к с иммунной сыво ро ткой анти-Н-2
Пример 2. Проверка активности 45 полученных полисиецифических аллоантисывороток с применением предлагаемого метода гемагглютинации (микрометод в микрокамере для иммунологических реакций). От тестируемых животных получают кровь из ретроорбитального синуса, выделяют и отмывают эритроциты и готовят их 1%-ную суспензию на фосфатно-солевом буфере рН .7,4, В микрокамеры для иммунологических реакций раскапывают по
10 мкл полученных аллоантисывороток, разведенных в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, содержащем 0,3% поливинил25
4 пирролидона и 17. нормальной мышиной сыворотки. Затем к иммунным сывороткам добавляют по 5 мкл 17.-ной суспензии тестируемых эритроцитов (использовано общепринятое соотношение обьемов аллоиммунной сыворотки и тестируемых эритроцитов). Инкубируют при комнатной температуре 1 ч и учитывают реакцию. Для учета реакции микрокамеры поворачивают.на ребро и выдерживают в таком положении 5 мин.
В случае отрицательной реакции эритроциты вытекают из лунки. При положительной реакции эритроциты склеиваются и образуют плотное кольцо на дне лунки. Реакцию можно также учитывать в микрокамере под -микроскопом.
Полученные результаты с использованием предлагаемого мстода представлены в табл. 2.
Из табл, 2 видно, что каждая полученная аллоиммунная.сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена. Так, эритроциты,мышей линии C57B1/10, имеющих генотип Н-. 2 /Н-2, дают положительэ в ную реакцию с иммунной сывороткой, s анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии
ВА1В/с, имеющих генотип Н-2 /Н-2 дают положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии СВА, имеющих генотип к к
Н-2 /Н-2, дают положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н-2".Таким образом, полученные полиспецифические аллоантисыворотки можно использовать как с применением макрометода гемагглютинации в пробирках, так и с применением микрометода гемагглютинации в микрокамере для иммунологических реакций.
Пример 3. Использование предлагаемого способа для контроля генетической однородности мышей инбредных линий. Способ осуществляют аналогично примеру 2, но в микрокамеры раскапывают по 10 мкл буфера, содержащего 0,9% нормальной мышиной сыворотки, Полученная аллоиммунная сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена.
Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 2, но в микрокамеры раскапывают по 10 мкл буфера, содержащего I 1% нормальной сыворотки.
Полученная аллоиммунная сыворотка хорошо.выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена.
35 типом.
Таблица l
Аллоиммунные сыворотки против различных антигенов Н-2
Генотип Н-2 мышей исследуемых линий
Мьпци линий
d1
Анти-Н- 2 Ан ти- Н- 2 Ан ти- Н-2
Н-2 /Н-2 в в
d d
Н-2 /Н-2 ,к к
Н-2 /Н-2
С5 7В1/10
BA1 В/с
СВА
+++
II р и м е ч а н и е: 0 — реакция отрицательная,"
+ ++ +++ — положительная реакция различной силы, В экспериментах использовано не менее 10 мышей каждой линии, 5 14
Н р и м е р 5, Контроль генетической однородности мышей линии СВА, а также мышей других линий, имеющих к гаплотип Н-2 . Формируют группы мышей по числу гаплотипов Н-2, являющихся потенциальными контаминаторами. Для получения полиспецифических аллоиммунных сывороток каждую группу животных иммунизируют клетками лимфоидной ткани мышей с определенным гаплоти— пом Н-2 по стандартной методике.
Схема получения полиспецифических аллоантисывороток на мышах линии к
СВА, имеющих гаплотип Н вЂ” 2, представ— лена в табл. 3.
Тестирование генетической однород ности исследуемых мышей с использованием полученных аллоантисывороток проводят с помощью микрометода гемагглютинации аналогично примеру 2..
Из табл. 4 видно, что каждая полученная иммунная сыворотка хорошо выявляет гаплотип, против антигенов которого она получена. Так, эритроциты мышей линии С57В!/6, имеющих генотип Н-2 /Н-2, дают положительную ,е в реакцию с иммунной сывороткой антиН-2; эритроциты мышей линии ВА1В/с, имеющих генотип Н вЂ” 2 /Н вЂ” 2, дают поло—
Ь Ь жительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н-2 ; эритроциты мышей линии
SWR имеющих генотип Н-2 /H-2, дают
° Ф положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н вЂ” 2 ; эритроциты мышей
58825 6 линии SJL, имеющих генотип Н-2 /Н-2 дают положительную реакцию с иммунной сывороткой анти-Н вЂ” 2 . В то же время мыши линии СВА и AKR, имеющие генотип Н-2 /H 2 со всеми исполь,к к. зованными аллоантисыворотками дают положительную реакцию.
Результаты контроля генетической однородности мышей линий CBA H AKR в реакции гемагглютинации с использованием аллоантисывороток, получен,,к ных на мышах линии СВА (H- 2 ), при— ведены в табл. 4.
)Ф о р м у л а и з о б р е т е .н и я
Способ контроля генетической однородности мышей инбредных линий путем получения специфической антисыворотки против антигенов Н-2, проведения серологического анализа и оценки генетической однородности по результатам серологического анализа, 25 о тлич ающий ся тем, что, с целью упрощения способа и повышения его эффективности за счет возможности проведения серологической реакции микрометодом, получают панель поли30 специфических антисывороток в результате иммунизации подлежащих проверке линий клетками лимфоидной ткани мышей, являющихся потенциальными контаминаторами с другим Н-2 гапло1458825
Таблица 2
Mbt1IIH JIHHHH
Генотип Н-2 мышей исследуемых линий
C57B1/10
ВА1В/С
Н-2 /Н-2
Ь, 8
Н-2 /Н-2 ,d d
+++ к
Н-2 /Н-2
СВА
+++
П р и м е ч а н и е: 0 — реакция.отрицательная;
+ ++ +++ — положительная реакция различной силы. В зкспериментах использовано не менее 10 мышей каждой линии.
Таблица 3
Специфич" ность по
Иммунизирующие гаплотипы Н-2 мышей
Мыши линий доноров клеток лимфоидных тканей лученной аллоантисыдоноров воротки
Н-2 ,d
ВА1Б/с
C57B1/6, Ь
Н-2,%
Н-2
SUR з
Н-2
$Л.
Группы иммунизируемых мышей линии
C 13A (мыш и реципиенты) Лллоиммунные сыворотки против различных антигенов Н-2 к з Г в
Анти-Н-2 Анти-Н-2 Анти-Н-2 к d
Н-2 анти-Н-2 .к в
Н-2 анти-Н-2, к, Ф
Н-2 анти-Н-2 к в
Н-2 анти-Н-2
1458825 о
I I о
Ф о I
I I
О +
+ о +
+ о +
I 11 4Г 3
53
Рю о о!
1 о I
Il о о о о о о! 1
° Ф
Э
Э
1 I
+ б
+ о
+
+ о о о + о о о о о о о о о о
+
+ о о
+
Ю
+
1 1! ! ! ! о
Э
O о
I 1
+
+ о + ж
I о о о о
+
+!!
1 ж сч
Ж. е еч сч
-1 1 C ,у а сч сч
I ж ж
Ф
"сч
И! М
1 Ю
1ОО
1 В о о й О с ф ф ил Я
-o
Рю
Cl
«ф ф ф и г ф
Гм в л о
Ж
h! 11o
I и 3 ,g
Ф О Х 1
IC»ХЦ1
Ф 1 ! Ц х, о о о о о о
О ! о о + о о +
+ о о +
+ о о,.+ о i +
+ + о + + о о
М Ю
1Ч СЧ СЧ
Ж Ю Я сч вч еч О
° а ф . ф ф л
8 ф о
Р
5 о
° Ф
i о