Средство, обеспечивающее устойчивость клеток к фаголизису

 

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение устойчивости культур Escherichia coli к различным бактериофагам,обладающим антирестрикционным механизмом, Bgtil - фрагмент ДНК области и иммунитета фага лямбда, обеспечивающий при введении в клетку в составе peri комбинантных ДНК устойчивость клеток к фагрвой инфекции, состоит из 2392 п.о., ограничен Bgfll сайтами рестрикции с координатами 35711 и ,38103 п.о. на ДНК фага лямбда; содержит интактные гены rex АВ; с1 ген с термочувствительной мутацией 857, определяемой .заменами с вместо Т в позиции 37589 (ind) 437742 (с1 857) и часть гена его с позиции 38041 по 38103 п.о. ДНК фага лямбда; Рг и Рт промоторы фага лямбда; 3 сайта Hindlll в позиции 36895, 37459, 37742 п.о. 3 табл. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (Ю4 С 12 N 7/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н автои;ком свидютельствм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ТННТ СССР (21) 4182508/31-13 (22) 16.01. 87 (46} 07.03.89. Бюл.N - 9 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) А.П.Чернов, А.С.Солонин, И.В,Захарова и В.И.Таняшин (53) 575.224.2:577.2(048)(088.8) (56) Benser SPNASUSA, 1955, v.41, р.344. (54) СРЕДСТВО, ОБЕСПЕЧИВА1ОШЕЕ УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК К ФАГОЛИЗИСУ (57) Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение устойчивости культур Escherichia coli к различным бактериофагам,обладающим

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и микробиологической промышленности и представляет собой средство для предотвращения фаголиэиса культур Escherichia coli.

Целью изобретения является повышение устойчивости культур Е.coli к различным бактериофагам, в том числе к бактериофагам, обладающим антирестрикционным механизмом. Bg Ill фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, обеспечивающий повышенный уровень экспрессии генов rex AB, при трансформации клеток рекомбинантными плазмидами, содержащими этот фрагмент, обеспечивает устойчивость клеток к фаговой инфекции, Наличие активных генов rex AB фага лямбда в составе этого фрагмента

„„SU„„3463759 А ) антирестрикционным механизмом.

BgtII — фрагмент ДНК области и иммунитета фага лямбда, обеспечивающий при введении в клетку в составе per комбинантных ДНК устойчивость клеток к фаговой инфекции, состоит из

2392 п.о., ограничен Bgfll сайтами рестрикции с координатами 35711 и

38103 п.о. на ДНК фага лямбда; содержит интактные гены rex АВ; cI ген с термочувствительной мутацией 857., определяемой заменами с вместо Т в позиции 37589 (ind ) 437742 (cI 857) и часть гена cro с позиции 38041 по

38103 п.о. ДНК фага лямбда; Pr u Pm промоторы фага лямбда; 3 сайта

HindIII в позиции 36895, 37459, 37742 п,о, 3 табл. приводит к ограничению роста некоторых мутантных фагов Т4 (5), Т5 (6)

Т7(7), ф 80(8) в лизогенных клетках, в то время как дикие формы перечисленных фагов растут на лизогенных культурах беэ ограничения, Повышенная активность генов rex AB фага лямбда, введенных в клетки Е.coli путем трансформации рекомбинантными плазмидами, содержащими область иммунитета фага лямбда и обеспечивающими повышенный уровень синтеза продуктов генов rex AB по сравнению с лизогенными клетками, ограничивает рост в этих клетках .диких форм бактериофагов Т4, Т5 Т7 и некоторых других.

Повышенный уровень синтеза продуктов генов rex осуществляется в клетках

Е.соli трансформированных рекомбиз 1463759 4 нантными плазмидами, содержащими об- Эффективность использования В8 7? ласть иммунитета фага лямбда.с интак- фрагмента ДНК области иммунитета фага тными генами rex AB и дефектными ге- лямбда в составе рекомбинантных плазнами репрессоров cI (термочувстви- мид для повышения устоичивости культельная мутация ts857) и cro (деле- тур E,coli к различным бактериофагам ция, Д, или амбермутация, аш6). показана в примерах 1-7.

Белки"продукты генов cI " и cro+ по- Пример 1. Клетки Е. coli давляют экспрессию генов гех АВ, по- В834 выращивают в 10 мл мясопептонэтому плазмиды с интактными генами !g ного бульона (ИПБ) до плотности 4 « репрессоров cI u cro не обеспечивают «!О кл./мл, осаждают центрифугироо культурам Е. coli достаточной устой- ванием !О мин при О С (K-23, 6000 об/мин) промывают дважды 20 мп

В III фрагмент ДНК области иммуни- холодного раствора, содержащего:

В тета фага лямбда, обеспечивающий при !r трис"НС1, рН 7,7 — 0,01N, СаС1 введении в клетку в составе рекомби- 0,1N, ресуспендируют в 10 мл этого нантных ДНК устойчивость клеток к фагавой инфекции, состоит из; ной бане, ресуспендируют в 1 мл раст2392 пары оснований; ограничен Bgfll вора. К 0,3 мл сУспензии клеток досайтами рестрикции с координатами и естр ции с координатами 20 бавляют 20 мкл раствора ДНК плазмиды

35711 и 38103 пар оснований íà ДНК PILRV8 с концентРацией 50 мкг/мл, ин- фага лямбда; и содержит интактные кубируют 50 мин при О С, 5 мин при гены гех АВ, сТ ген с термочувстви- 42 С., добавляют два объема среды тельной мутацией 857, определяемой LBi выд Рживают 30 мин пРи 37 С и заменами С вместо Т в позиции 37589 2Б высевают на агаР содеРжащий (хай ) и 37742 (сХ 857), и часть 30 мкг/мл хлорамфеникола. Выросшие гена cro с позиции 3804! по .38103 пар х31«» отбирают и определяют их усоснований ДНК фага лямбда Pr u Pm- тойчивость к бактериофагам.

Э

+ промоторы фага лямбда, 3 сайта Бактериофаг 75 выращенный на

HindIII в позициях 36895, 37459, . ЗО культуре E. coli В834, высевают на

37742 пар оснований. газон культуры Е.coli В834, трансЭтот фрагмент может быть введен формированной плаэмидай pILRU8, К в ранее сконструированные рекомби". 2 мл мягкого агара, приготовленного н ан тные ДН К (н апример, пл аз миды) с на среде LB с добавкой 10 мм СаС7, целью повышения устойчивости культуры добавляют при 37 С 1 «10 свежих !! к фаговой инфекции. клеток в 0,2 мл среды и по 10 час

Плаэмиды использованные в приме- тиц фага. Т5 на первые две чашки, по

Ф 1 рах,приведены в табл. 1. 10 на вторые две чашки и по 0 на . Плазмиды рП. 202, р Ц.209, рс.!,857 третьи две чашки. Для контроля фаг Т5 содержат фрагменты области иммунитета 4О высевают аналогично на чашки с газо фага лямбда с пониженной активностью ном культуры Е.coli В834 без плазмиды. о гeHQB rex ЛВ и служат контролем для Чашки инкубируют при 37 С 16 ч и выявления генов фага лямбда, сущест- определяют эффективность высева фага венных для ограничения Роста различ- в. опытных чашках и контрольных. На ных бактериофагов в клетках Е, coli. 45 газоне в опытных чашках не видно неПлазмида рсХ857 не несет rex АВ- гативных колоний фага Т5, Трансформиактивности из-эа делеции в генах рованные клетки устойчивы к фагу 75. гех АВ. Проведенный анализ позволяет заключить, что культура Е.coli В834/

Плаэмида pIL202 имеет очень низкую 5р ppILRV8 устойчива ко всем используеактивность генов rex АВ из-за нали- мым в данной работе бактериофагам, чия интактных генов репрессоров cI в том числе и к Piimm434 и к ТЗ и и cro. частично устойчива к фагу Т7 (менее

Плазмида pIL209 имеет низкую ак- 507 мелких колоний с диаметром около тивность генов rex AB из-за иитакт- 1 мм). Ограничение фагов ТЗ и i 434 ного гена-респрессора cro. определяется наличием в плазмиде генов системы рестрикции-модификации

Остальные плазмиды имеют высокую E.C0RV и присутствием сайтов, узнаваактивность генов rex AB, емых этой эндонуклеазой, на ДНК этих

1463

5 бактериофагов. Фаг ТЗ ограничивается активностью генов rex АВ фага лямбда и системой рестрикции Е.CORV фаг Т7, который не имеет на своей

ДНК сайтов Е.CORV только активностью

5 генов rex AB, а фаг imm434 ограничивается только активностью гена, кодирукщего эндонуклеазу рестрикции

Е.CÎRV. 10

Зависимость устойчивости клеток

Е,coli B834/pILRV к бактериофагам от температуры культивирования осуществляют аналогично примеру 1, только чашки с высеянным фагом Т5 инкубируют 15 при 26, 32, 38 С.

Показано, что при 26 С на агариэованной среде падение титра фага Т5 составляет около 90Х при 32 С паде ние титра достигает 99,9Х, при 38 С 20 культура полностью устойчива к фагу Т5.

Определение устойчивости клеток

Е.coli В834/pILRV8 к бактериофагам при культивировании в жидкой среде. 25

К культуре клеток Е.со1i В834, трансформированных плаэмидой pILRVS с плотностью 5 «10 кл./мл в ИПБ, до. бавляют фаг Т5 с множественностью

0,3 и инкубируют при 37 С в условиях 30 интенсивной аэрации 5 ч. За это вре" мя культура .выходит в стационарную фазу, лизиса культуры не наблюдают, так как клетки устойчивы к бактерио фагу Т5.

Аналогично проводят определение устойчивости клеток Е.coli/pILRV8 х фагу Т4, ТЗ, Т7, ф 80, Р22, Л i434 ° . В случае фагов Т4, ТЗ, ф 80, Р22, Зi434 лиэиса не наблюдают, так как 40 клетки устойчивы к перечисленным бактериофагам и частично устойчивы к фагу 77.

Определение урожая фага Т5.

Клетки Е. со1. Â834/pILRU8 выращивают 45 в 10 мл ИПБ до плотности 3 108 кл./мл, осаждают центрифугированием (6000,.

1О мин} и ресуспендируют в 1 мл ИПБ.

В суспенэию клеток добавляют. фаг 15 с множественностью 0,5-0,8 и провоо дят адсорбцию фага !0 мин при 10 С.

В этих условиях на клетках адсорбируют свыше 90Х всего фага (в среднем

95X), Затем быстро делают разведения клеток в 10 раз s пробирках с холод- 55 б ным ИПБ (10 С) так, чтобы в последней пробирке было 3 "10> кл/мп, Из этой пробирки отбирают аликвоты по 0,1 мп для титрования фага (титр 1) на га-, 759,6 зоне Е. coli В834 при 37 С, затем содержимое пробирки делят пополам, нагревают на водяной бане одну пробу до 30 С, вторую до 37 С и инкубируют пробы при указанной температуре и усиленной аэрации 1,5 ч. Затем отбирают аликвоты по 0,1 мл и проб для второго титрования (титр 2). .Титр 1 равен сумме инфицированных клеток, дающих фаговое потомство и неадсорбированных инфекционных фаговых частиц. Титр 2 соответствует урожаю из инфицированных клеток.

Отношение титра 2 к титру 1 приближенно характеризует выход фага на одну кпетку.

Результаты одного из трех независимых опытов представлены в табл.2, в которой приведены также данные, полученные при анализе урожая фагов

Т4 и Т7, а также при анализе урожая фагов Т5 Т4 и Т7, выросших на куль" туре E.coli В834 без плазмиды и с плазмидой pIL203 которая содержит область иммунитета фага лямбда с интактными генами rex АВ и мутантными генами респрессоров с1857, и скоаш6.

Из табл.2 следует, что в клетках

Е.coli B834 трансформированных плазмидами с повышенной активностью генов rex,выход фагового потомства значительно ниже, чем в бесплазмидных клетках.

При повышении температуры культио вирования с 30 до 37 С выход фага из клеток E. coli В834, трансформированных плазмидами pIL203 и pILRV8, значительно снижается, При инфицировании клеток Е,coli

В834,трансформированных плазмидой.

pILRV8, фагами Т4 или Т5 при 37 С, инфицированные клетки не дают фаго-. вого потомства, т.е. инфекция в этих условиях протекает абортивно.

Плазмида pILRUS сильнее подавляет рост фагов, по сравнению с pIL203 что возможно объясняется с слабой супрессией мутации am6 гена cro в штамме E ° coli В834.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, испбльзуя вместо клеток E.coli В834 клетки E.cali

С600.

Проведенный анализ позволяет заключить, что клетки Е.coli С600/

/pILRV8 устойчивы к бактериофагам

Т4, Т5,ТЗ, Ф 80, Р22 Л1ппп434, К фагу

Т7 наблюдают частичную устойчивость

1463759 при выращивании культур на агариэо.ванной и жидкой средах. Урожай бакте" .риофагов Т5, Т4, Т7 падает соответственно в 100, 100 и 10 раз.

Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместо клеток Е,coli 3834 клетки Е.со1з С.

Проведенный анализ позволяет заключить, что культура E.coli С/ 10

/рХЖЧ8 устойчива ко всем используемым бактериофагам, кроме фага Т7 при ,культивировании как в жидкой, среде, так и на агаризованной среде, К фагу

Т7 наблюдают частичную устойчивость. 15

Эффективность защиты от фаголизиса зависит от температуры. Оптимальной температурой для осуществления спосо-! ба является 37-38 G. Урожай бактерио" о

| ,фагов при росте на культуре Е.со1х 20

| С/yILRV8 резко понижен по сравнению с урожаем на бесплазмидном штамме.

Пример 4. Осуществляют анало гично примеру I используя вместо, плазмиды рПКЧ8 плазмиду pFRD35, 25

Трансформацию клеток Е.coli 8834 плазмидой рУЮ35 проводят как опи. сано в примере 1. Селективная среда содержит 20 мкг/мл ампициллина. Прове,,денный анализ показал, что клетки З0

lE.coli 3834/pFRB 35 достаточно устой(о ., чивы при 37 С к бактериофагам Т7 и ! !

ТЗ при росте как в жидкой так и на, твердой среде.

Пример 5. Осуществляют ана- 35 логично примеру 4, используя вместо клеток Е,соli В834 клетки Е,coli

С600,. Проведенный анализ позволяет заключить, что клетки E„coli С600/

/рУШ) 35 при 37 С устойчивы к бакте- 40 риофагам Т5, ф 80, Р22. К фагам Т4, Т7, ТЗ, наблюдают частичную устойчивость при выращивании культур на агариэованной и жидких средах, Пример 6. Осуществляют ана- 45 логично примеру 4, используя вместо клеток Е.coli В834 клетки Е.coli С.

Проведенный анализ позволяет заключить, что культура Е.coli С/pPRD 35 устойчива к фагам T5, . p 80, Р22, 50 частично устойчива к фагам Т4, Т7, ТЗ, не устойчива к фагу 3 i 434 при культивировании как в жидкой, так и на агарнзованной среде. Эффективность защиты от фаголизиса зависит от температуры, оптимальная температура для осуществления способа 3738 ОС.

Пример 7. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместо плазмиды р LRV8 плазмиду рп.203.

Проведенный анализ показал, что эта плазмида повышает устойчивость клеток к фаговой инфекции. Урожай фагов при росте на E.coli B834/pIL203 при о

37 С в среднем приблизительно в

100 раз ниже урожая при росте на бесплаэмидном штамме в случае фагов Т4 и Т5 и в 10 раз ниже в случае фага.

Т7.

В табл.3 приведены обобщенные результаты примеров 1-7.

Устойчивость культур Е,coli, трансформированных рекомбинантными ппаэмидами, содержащими Bglll фрагмент ДНК области иммунитета фага лям бда к бактериофагам, приведена также в табл.3.

Использованный нами Bg2II фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами гех АВ, термочувствительным геном cI 857, в составе рекомбинантных плаэмид обеспечивает устойчивость клеток

R,coli к различным бактериофагам, в том числе к бактериофагам, обладающим антирестрикционным механизмом, по сравнению с известным фрагментом.

Наличие в составе BgglI фрагмента промотора Pr, регулируемого термочувствительным репрессором сХ, делает этот фрагмент ДНК удобным для конструирования векторов с регулируемой . экспрессией генов. Одновременно клетки E,coli трансформированные этими векторами, делаются устойчивыми к фаговой инфекции.

Формул а изобр е тения

Применение BglII фрагмента ДНК области иммунитета фага лямбда в качестве средства, обеспечивающего при введении в клетку в составе рекомбинантных ДНК устойчивость клеток

Escherichia coli к фаголиэису.

1463759

Таблиц а 1 !.

Гены области иммунитета фага лямбда

Ссыл ки

Ппазмида

Маркеры

Репликон

pMBI

rex АВ+, cI+ сго

rex AB, cIts857 cro+

Ар" (10) (10) (11, 12) (10) (9) (12) р П.202 рП,209

pcL857

pl5

АВ+, cIts857 cro и

AB,cIts857 сгоавб

AB, cIts857 cro cf

AB, cIts857 crom

rex

pIL203

pILRV8

pFRD35

pMB I

rex

Ap I EC0RU

Ар", Тр

rex

pMB I

rex

П р и м е ч а н и е.. Плазмида pIL209 получена по схеме конструиро-. вания плазмиды рП 203, но в качестве донора области иммунитета используют ДНК фага лямбда

cI857.

Таблиц а 2

Фаг Т5

Фаг Т7

J рП.203

pILRV

pIL203 pILRV р П.203 рПжВ у а, С

21

313 164

30 36000 3100

3l 4300 390

30 115 19

37 137 2 5

Титр l

Титр 2

Ти 2 т2

Титр 1

Таблица 3

Клетки, трансформированные ппазмидой

Гены области иммунитета Устойчивость трансформирофага лямбда ванных культур

1 1

Т5 Т4 Т7 ТЗ 9 80 Р22 М i434

Плазмиды,обе спечивакщие устойчивость к фагам

pIL 203 Ар rexAB cIts

pILRV8 Ap " rexAB cIts

pFRD 35 Ар" T," rexAB cIts сгоатб

cro д

cro a

+ . + 4 + +

Ф + чивакщи

cro+

cro+ е устойчивости к фагам, с".о д.

cro у I Н II

П р и м е ч а н и е, + — культура устойчива к данному фагу, — — не устойчива; "+ — частично устойчива. 1

Ппазмиды, не

pIL209 Ар" гехАВ+ рП.202 Ар" rexAB

pcI857 Km rexAB

pBRÇ22 Ар"Тс гехАВ обеспе

cI ts сТ

cIts

cLI

243 119

38000 2400

41000 470

156 20

169 .4

33 178 !52

640 32000 6900

52 37000 1!10

l80 45

204 7

113 ! 470

581

13