Рекомбинантная плазмидная днк ptur1-6 для идентификации межиндивидуального полиморфизма днк человека и способ ее получения

 

Изобретение, относится к области генетической инженерии и генетики . человека и может быть использовано для определения высоких межиндивидуальных различий ДНК человека. Цель изобретения - создание рекомбинантной ДНК для определения межиндивидуального полиморфизма по вариабильным геномным участкам человека. Новые рекомбинантные плазмиды ДНК pTVRl-6 состоят из фрагмента ДНК человека и Изобретение относится к области генетической инженерии и генетики человека и может быть использовано для определения высоких межиндивйдуальных различий ДНК человека с помощью полученных рекомбинантных плазмидных ДНК, что обеспечивает возможность его применения в медицинской, популяционной генетике и в криминалистике . . ДНК-полиморфизм активно используется при проведении генетического анализа человека: в пренатальной вектора PBR 322. Фрагмент геномной ДНК человека размером 2,7 .о содержит последовательно сцепленные сайты рестрикции: Pstl-EcoRI-Hind III- BamHI- Pstl. Рекомбинатная плазмида позволяет идентифицировать высокий межиндивидуальный полиморфизм проб ДНК человека. При зтом практически каждый индивид имеет специфическое распределение рестриктных фрагментов, гомологичных данной рекомбинантной плазмидной ДНК. В то же время распределение таких фрагментов идентично в ДНК из разных тканей одного и того же индивида. Т.аким образом , изобретение может быть использовано для идентификации высокой нежиндивидуальной вариабильности ДНК человека, которую можно эффективно проводить на любых клеточных тканях, содержащих ДНК от разных лкщей, с -.целью установления принадлежности ткани конкретному человеку. 2 с.п. ф-лы. .диагностике, картировании групп сцепления генетических локусов, непрямой локализации групп генов, ответственных за наследственные болезни изучении роли рекомбинаций в канцерогенезе . Наиболее перспективными в таком анализе считаются клонированные фрагменты ДНК, характеризующиеся межиндивидуагаьным полиморфизмом по длине фрагментов (ДД рф.) . Целью изобретения является создание рекомбинантных ДНК для определения межиндивидуального полиморфизма С О) 4 О) СО VI Oi

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1511 4 С 12 N 15/00.1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

llPN ГКНТ СССР (21) 4268041/28-13 (22) 26.06.87 (46) 07.03.89. Бюл.9 9 (71) Институт клинической психиатрии

Всесоюзного научного центра психического здоровья АИН СССР (72) Е.И.Рогаев и 10.А»Шапиро (53) .575.224.2.577.2(048)(088.8) (56) Nature, 1985, ч.315, р.67-73, {54) РЕКОИБИНАНТНАЯ ПЛАЗИИДНАЯ ДНК

pTVRl-6 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИЕЖИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗИА ДНК ЧЕЛОВЕКА

И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ (57) Изобретение относится к области генетической инженерии и генетики человека и может быть использовано для определения высоких межиндивидуаньных различий ДНК человека, Цель изобретения " создание рекомбинантной

ДНК для определения межиндивидуального полиморфизма по вариабильным геномным участкам человека. Новые рекомбинантные плазмиды ДНК p R1-6 состоят из фрагмента ДНК человека и

Изобретение относится к области генетической инженерии и генетики человека и может быть использовано для определения высоких межиндивидуальных различий ДНК человека с помощью полученных рекомбинантных плазмидных ДНК, что обеспечивает возможность его применения в медицинской, популяционной генетике и в криминалистике.

ДНК-полиморфизм активно используется при проведении генетического анализа человека: в пренатальной

ÄÄSUÄÄ 1463760 А 1 вектора PBR 322. Фрагмент геномной

ДНК человека размером 2,7 т.п.о. со держит последовательно сцепленные сайты рестрикции: Ps tI-EcoRI-Hi nd I I E3amHI- Ps tI. Рекомбинатная плазмида позволяет идентифицировать высокий межиндивидуальный полиморфизм проб ДНК человека. При этом практически каждый индивид имеет специфическое распределение рестриктных фрагментов, гомологичных данной ре комбинантной плаэмидной ДНК. В то же время распредеЛение таких фрагментов идентично в ДНК иэ разных тканей од ного и того же индивида. Vаким образом, изобретение может быть испольс0 зовано для идентификации высокой межиндивидуальной вариабильности ДНК человека, которую можно эффективно проводить на любых клеточных тканях, С

l содержащих ДНК от разных людей, с целью установления принадлежности ткани конкретному человеку. 2 с.п. ф-лы, 4 в диагностике, картировании групп

-сцепления гене тиче ских ло кусов, непрямой локализации групп генов, ответственных за наследственные болезни, изучении роли рекомбинаций в канцерогенезе. Наиболее перспективными в таком анализе считаются клонированные фрагменты ДНК, характеризующиеся «Ъ» межиндивидуальным полиморфизмом по длине фрагментов (ПД РФ), Целью изобретения является создание рекомбинантных ДНК для определения межиндивидуального полиморфиэма

1463760! по вариабильным геномным участкам человека.

Рекомбинантная плаэмидная ДНК ,pTVR1-6 состоит иэ фрагмента генома человека, вектора, реплицирующегося в E.coli.

Плазмида отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека, имеющим три внутренних уникальных сайта рестрикции: EcoRI, HindIII, BamHI и ограниченного PstI-сайтами с разных концов.

Плазмида pTVRI-6 состоит из следующих элементов: плазмидной ДНК вектора pBR 322 размером 4,36 т.п,о., PstI-геномного фрагмента человека размером около 2,7 т.п.о., содержа1 щего последовательно сцепленные сайты рестрикции: Pstl-EcoRI-11indIIIВапйП-PstI.

Молекулярный размер плазмиды

pTVR1-6 равен 7,1 т.п.о,.

Способ .клонирования и селекции рекомбинантной плазмиды имеет следующие особенности. .Выделение геномных фрагментов gHK человека осуществляют прямым клонированием их в плаэмидный вектор беэ обычного принятого предварительного клонирования геномной ДНК в фаговых библиотеках.

Трансформацию полученных рекомби-, нантных плазмид во всех случаях осу- ществляют в recA штаммах.

Отбирают рекомбинантные плазмиды.

ДНК, содержащие фрагменты ДНК низкоили умереннокопийные в геноме человека в два этапа: первый " отбор

II клонов, не дающих сигнала нри колони-гибридизации" с Э Р-меченой тотальной ДНК человека; второй — отбор из этих клонов методом "Hot ãèáðèäèçàции последовательностей ДНК, копийность которых не превышает 1000 на гаплоидный геном человека.

Регистрацию полиморфизма проводят гибридизацией отобранных плазмид на NspI-переварах ДНК от трех индивидов, представляющих популяции, длительное время генетически изолированные друг от друга.

Рекомбинантные плаэмиды, дающие межиндивидуальный Mspl полиморфизм> используют для анализа полиморфизма

ДНК, гидролиэованной по различным рестриктаэам от 2-3 индивидов и обычной смешанной популяции, Затеи межиндивидуальный полиморфизм устанавливают на пробах ДНК от большого числа людей, гидролизованных по сайтам рестрикции, для ко5 торых на стадии 5 выявляется наиболее выраженная межиндивидуальная вари абел ьно ст ь.

Клонирование геномных фрагментов

10 непосредственно в плаэмидные вектора и проведение трансформаций и размножения получаемых рекомбинантных плаэмид в recA штаммах Е.coli позволяют добиться стабильного клонирования

15 высокополиморфных фрагментов ДНК.

Повторяющиеся или высокополиморфные структуры ДНК нестабильны или вовсе не клонируемы в recA+ штаммах Е.coli

Отбор клонов, копийность которых:

2р не превышает 1000 на гаплоидный геном, позволяет выделять рекомбинантные плаэмиды. дающие картину гибридиз ации с р ес трициров анной ДНК человека в виде дискретных полос.

25 Гибридизация с переваров ДНК по

MspI-сайтам, имеющим в своем составе динуклеотид СС, повышенно мутабильный в геноме, и использование проб человека от генетически изолированных

30 групп повышают вероятность идентификации межиндивидуального полиморфиэма.

Пример 1. Плазмидную ДНК

pBR 322 и ядерную gHK человека подвергают гидролиэу рестриктаэой PstI образовавшиеся фрагменты соединяют

ДНК-лигазой, полученной смесью трансформируют клетки Е.со11 штамм НВ101 (recA ). Трансформанты высевают на

40 среду с Тс. Выросшие клоны пересевают параллельно на среду с Тс и среду с Ар, Отбирают клоны, растущие на

Тс, но не растущие на Ар. Эти клоны содержат рекомбинантные плазмидные

45 ДНК. Несколько сотен клонов, содержащих рекомбинантные плаэмидные ДНК, высевают на фильтры и колони гибридизируют с P-меченой тотальной ДНК человека.

Отбирают клоны, не дающие сигнала на радиоавтографе, т. е. не гибридиэирующиеся с высокоповторяющейся фракцией генома человека. Рекомбинантные плазмиды из нескольких отобранных

55 таким образом клонов Ð метят и

"dot" гибридиэируют с пятнами ДНК на фильтрах: 5 мкг тотальной ДНК человека и разведениями pBR 322 от 10 до

10 мкг, Клоны, копийность которых

1463760 не превышает 100 копий на геном, фильтр переносят на бумагу с 3 мм, гибридизируют с NspI-гидролизатом насыщенную буфером SSPE» 2 (0,36 М тотальной ДНК человека от трех индиви-. NaC1, 20 мМ NaH>P0<,ðÍ 7,4 и 2 мМ дов. При гибридизации одного из кло- 5 ЭДТА, рН 7,4), и сушат при комнатной нов (pTVR1-6) обнаружено, что все температуре колониями вверх, ДНК фиктри индивида отличаются, друг от друга сируют на фильтре нагреванием под по распределению рестриктных фрагмен- вакуумом в печи при 80 С B течение тов. 30 мин.

В дальнейшем анализируют ДНК 2-4 10 Непосредственно перед гибридизацииндивидов, гидролизованных по EcoRI, ей Фильтры с фиксированными ДНК инкуBamHI, PstI, SacI, Eco8I, BgfIl, .бируют 5 ч при 42 С в предгибридиэаHindIII рестриктным сайтам. Наиболее ционном растворе, содержащем 507,-ный выраженный полиморфизм выявлен при, формамид» 5»SSC (0,75 И БаС1, использовании PstI-рестриктазы., 15 0,075 И цитрата натрия, рН 7,0), Оптимальные условия электрофореза 50 MN NaH2PO<, рН 6,5, 350 мИ 0,1Х при этом: длинная разгонка в 0,57.- поливинилпироллидона, 100 мкг гепари" ной агарозе для разрешения близко на, 0,57 саркозил, 200 мкг/мл полиАрасположенных фр.агментов (от 2,7 до ДНК.

5 т.п,о.). 20 Для проведения гибридизации фильт"

Исследование PstI"ãèäðîëèçàòîâ ры вынимают из предгибридизационного

ДНК 20 человек показывает, что все раствора и помещают в чашки, содержаони отличаются друг от друга по дли- щие на каждый фильтр по 1 мл гибрине и (или) копийности рестриктных дизационного раствора, имеющего тот фрагментов, гибридизирующихся с 25 же состав, что и предгибридизационная

pTVRi-6. Подобная картина соблюдается смесь с добавлением лишь P-меченой

32 и для pRTR1-6, содержащей тот же . тотальной ДНК человека. геномный Фрагмент человека. Для получения меченой пробы в

II р и м е р 2, Рекомбинантная раствор, содержащий 0,5 мкг плацентарплазмидная ДНК pTVR1-6. 30 ной ДНК человека, 50 мМ трис-НС1, Для проведения гибридизации бакте- (pH 7)» 7»5 MN NgC1<» 10 MN ДТТ» рориальных колоний Е.coli клоны E.со1, бавляют ДНКазу ? до концентрации 2 " содержащие в векторе pBR 322 случай- >10 — !О мкг/мл, один из Р-дезные PstI рестриктные фрагменты ДНК окситрифасфатов с удельной активнос.человека, растят на чашках с агаром 35 тью 1 I O TBg/ììîëü (3000 Ки/ммоль) ° в присутствии Тс. Колонии переносят 20 нМ каждого из немеченых предшестодновременно на агар с Тс в конт- венников ДНК-дезокситРифосфатов и рольной чашке и на идентичные места 5 е.а. ДНК-полимеразы I. Реакционную на круглый нитроцеллюлозный фильтр смесь, имеющую конечный объем 100 мкг, диаметром 8,5 см, лежащий на поверх- 40 инкубируют 20 мин при комнатной темности агара с тетрациклином (Тс) во пературе и 2 ч при 10 С. Удельная второй чашке. После подращивания ко- активность меченых препаратов составлоний при 37 С 15 ч контрольную чашку ляет 6,8«10 имп/мин/мкг. На каждый хранят при 4 С в перевернутом поло- фильтр суммарно наносится 4:10 имп/ жении, а бактерии на нитроцеллюлозиом 45 /мин меченого препарата ДНК. фильтре лиэируют. Для этого каждый Гибридизацию проводят при 42 С фильтр помещают на поверхность бума- 14 ч. Затем фильтры отмывают в двух ги 3 мм, пропитанной 107. SDS на сменах 1 ° SSC 0,57 БДЯ при комнатной

3 мин, затем на второй лист бумаги температуре, в двух сменах 0,5 ° SSC

3 мм, насыщенный денатурируюцим раст- 50 О,JX Sl1S при 67 С в течение 2 ч. вором (0,5 N NaOH ),5 И NaC1) на Фильтры высушивают и помещают на

5 мин. Далее фильтр переносят в ней- экспозицию с рентгеновской пленкой трализующий раствор (1,5 NaC1, РИ-! с усиливающими экранами. Время

0,5 И трис-НС1, рН 8,0) на 5 мнн. экспозиции составляет 2 сут.

Обломки клеток с поверхности фильтра 55 После проявления пленкУ с сигнала.осторожно стирают ватой, смоченной в ми гибридизации сравнивают с кон

5X SQS. Эта процедура необходима . рольной чашкой, Каждую из нескольких для снижения неспецифической фоновой сотен колоний на чашке, соответствую гибридизации с колониями. Далее: щих клонам, которые не дают сигнала

1463760

) а радиоавтографе, засевают в 5 мл

ТВ-бульона с тетрациклином (15 мкг/мл) фа ночь при 37 С и выделяют плазмид; фую ДНК щелочным методом.

Далее оценивают размеры PstI5

Ь тавок ДНК человека, содержащихся в выделенных рекомбинантных плазмидах.

Для этого 1 мкг плазмиды расщепляют в стандартных условиях. 10

Эндонуклеазой рестрикции P s tI гидроизуют 1 мкг плазмиднай ДНК в буфере, соержащем 10 мМ трис-НСТ, 10 мМ MgC1>, 1О мМ 2-меркаптоэтанола. Инкубируют и 37 С 1 ч. Полученные фрагменты елят электрофорезом в 0,7%-ной агаозе и сравнивают с маркерными PstIрагментами ДНК фага. Длина PstI1 ставки рекомбинантной лазмиды

Т73.1-6, определенная таким образом, 20 авняется примерно 2,7 т.п.о. По ,1 мкг каждой иэ рекомбинантных

° ° ° азмид Р метят в тех же условиях, оторые описаны для мечения тотальой ДНК человека в примере 2. Исклю- 26 ение состоит в том, что ДНК-полимера у I вносят в реакционную смесь лишь через 30 мин после.добавления ДНК-азы с целью предотвращения включения начале полимеразной реакции Ðезькситрифосфата в хромосомную ДНК .co1i следовые количества которой сегда присутствуют в плазмидных препаатах ДНК, выделенных щелочным методом. о 2Ч О имп/ми меченой плаэмидной

К используют для "dot"-гибридизации

ДНК в "пятнах". Оценивают копий ость клонированных фрагментов ДНК геноме человека и их эволюционную консервативность.

"Do t"-фил ьтры го то вя т следующим обр азом.

В пробирки, содержащие по 5 мкг геномной ДНК человека, зеленой мар. . гышки, крысы, быка, а также плазмид- 45 ной ДНК pBR 322 концентрацией 10

Щ-, 10-З, 10-, 10=S „„„./ „ДНК, добавляют 0,1 объема ЗМ NaOH. Инкубируют 1 ч при 56 С, Охлаждают до ,20-25ОС и добавляют один объем 2М NH+

)(РН 7,0). Пробы полностью, но не:большими порциями, с подсушиванием раскапывают на нитроцеллюлозные фильтры. "Dot"-гибридизацию с Ð-мечеными рекомбинантными плазмидами проводят в условиях, описанных.для

"колони" — гибридизации (пример 2).

Отмывку фильтров проводят в трех сменах О, I SSC 0,1% БДЯ при 67 С.

Сравнивая интенсивность сигнала пятна ДНК человека с сигналами в разведениях pBR 322, оценивают процентное содержание клонированного фрагмента в ДНК человека и, в пересчете на длину ставки, его копийность в геноме. Одновременно по присутствию или отсутствию сигнала в ДНК животных определяют распространение клониро-. ванных фрагментов ДНК в различных таксономических группах.

После проведенных этапов селекции

pTVR1-6 выделяют как рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент с копийностью не более 100 на гаплоидный геном (в расчете на полноразмер" ную копию 2,7 т.п.о.) и представленный у всех анализированных животных, Рекомбинантные плазмиды, содержаI щие фрагменты, копийность которых не превышает 100 на гаплоидный геном, гибридизируют с Nspl- гидролизатами . лейкоцитарной ДНК от трех индивидов, относящихся к генетическим изолятам.

МярТ-рестрикцию 10 мкг ДНК от каждого индивида проводят в стандартных ус" ловиях. Реакционная смесь содержит

10 мМ трис-НС1, 10 мМ NgClq 10 мМ

2-меркаптоэтанол, 10 мкг ДНК, 3% ед. акт (е,а,) фермента. Инкубациюосуществляют 10 ч при 37 С. Фракционируют ДНК электрофорезом в 0,7%-.íîì агарозном геле 14 ч при U = 50 В, = 30 mAÄ Перенос ДНК на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр проводят по методу Саузерна.

Условия мечения рекомбинантных плазмидных ДНК и гибридизацию проводят, как описано для "dot"-гибридизации в примере 1. На фильтр размерами 13 5 см наносят 3 мл

1 гибридизационной смеси с суммарной радиоактивной активностью 0,2 мкг плазмидной ДНК 8 «10 имп/мин. В этих условиях при гибридизации pTVRI-6— зонда обнаруживают, что все три индивида отличаются друг от друга по распределению некоторых МярТ-рестрик" тных полос. Таким образом, с помощью

pTVR1-6-плазмиды выявляют межиндивидуальный полиморфизм ДНК.

Пример 3. Высокий межиндивидуальный полиморфизм человека, выявляемый с помощью pTVR1-6-рекомбинантной плазмиды.

По 20 мкг плацентарной ДНК от 2-3 индивидов из смешанной популяции расщепляют EcoRI Hindlll BamHI

1463760

PstI, BgfII, MvaI, Есо81, SacI — эндонуклеазами рестрикции в стандартных условиях„ как описано в примере 1, варьируя в зависимости от используе5 мого фермента лишь содержание NaCI от 0 до 50 или 100 мМ. Фрикционирование рестриктных фрагментов, их перенос на фильтры и гибридизацию проводят как описано для Yspl-гидролиэо- 10 ванных проб ДНК (пример 1) . З Pмечение pTVRI -6-плазмиды осуществляют с помощью " ник-трансляции аналогично примеру 2. Анализ полученных радиоавтографов показывает, что про- 15 бы любых гидролиэатов ДНК от разных индивидов отличаются друг от друга по обшей картине распределения рестриктных фрагментов, гомологичных

pTVRI 6 плазмидной JIHK. Наиболее от- 20 четливо межиндивидуальные различия видны при сравнении PstI-рестриктных фрагментов ДНК. Идентификацию этих фрагментов от 20 индивидов, гомологичных.pTVRI-б-плазмидной ДНК проводят в условиях блот-гибридизации как описано для рестриктных гидролизатов ДНК в примерах 2 и 3. При этом фильтр размерами 20 20 см помещают в

15 мл гибридизационного раствора,. 30 содержащего 0,3 мкг э Р-pTVRI-6-ДНК с активностью 4 10" имп/мин. В таких же условиях проводят гибридизацию

$l

P-рТЧИ-6 ДНК с PstI-гидролизованны ми пробами ДНК, выделенными из разных д5 тканей от одного и того же индивида.

Демонстрируют, что распределение

Ps t I-рестриктных фрагментов ДНК, гомологичных pTVRI -6 — зонду, различно у двух любых сравниваемых индивидов, 40 идентично в разных тканях от одного и того же индивида. Эти данные позвол я ют и с пол ь з о в ат ь p TVR 1-6- пл аз мидную ДНК в качестве зонда в кримина-листике для идентификации индивиду- 45 альной принадлежности проб клеточной ткани, а также в популяционном и медико-генетическом анализе человека.

Из примеров 1-3 следует, что выделена рекомбинантная плазмида, поэво- 50 ля ющая идентифицировать межиндивидуальный полиморфизм проб ДНК человека, гидролиэуемых любой эндонуклеазой рестрикции. При этом каждый индивид ° имеет специфическое распределение 55

PstI-рестриктных фрагментов, гомологичных данным рекомбинантной плазмидной ДНК. В то время как распределение таких фрагментов идентично в ДНК из разных тканей одного и того же индивида.

Таким образом, изобретение может быть использовано для идентификации высокой межиндивидуальной вариабельнос-.и ДНК человека. Такую идентификацию можно эффективно проводить на любых и не обязательно одних.и тех же клеточных тканях, содержащих ДНК, от разных лкдей с целью установления принадлежности ткани конкретному ,человеку, Изобретение может найти применение в криминалистике, медицине> а также в популяционной генетике для определения возможного генетического родства и расстояния между исследуемыми группами людей, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pTUR1-6 для идентификации межиндивидуального полиморфизма ДНК человека размером 7,1 т. п.о., содержащая плазмидную ДНК вектора pBR 322;

PstI-геномный фрагмент человека pasмером; имеющий высокий межиндивидуальный полиморфизм рестриктных фрагментов ДНК генома человека,; гомологичных этому фрагменту; уникальные сайты рестрикции:

PstI, EcoRI, HindIII, BamHI,PstI) ген устойчивости к ампициллину Amp"; круг хозяев: Escherichia coli.

2, Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pTVRI 6, заключающийся в том, что рестриктные фрагменты генома клонируют в плазмидный вектор

pBR 322, трансформируют полученной рекомбинантной плазмидой recA штаммы

Е,coli, размножают, отбирают клоны, не дающие интенсивного сигнала с меченой тотальной ДНК человека, отбирают клоны, копийность которых не превышает 1000 копий на гаплоидный геном и которые гибридизируют с ДНК разных животных, затем отбирают плаз" мидную ДНК pTVRI-6, дающую межиндивидуальный полиморфизм при гибридизации с Mspl u PstI-рестриктными переварами ДНК нескольких индивидов.