Способ получения преднизолона

 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения преднизолона. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ осуществляется выращиванием культуры А. globiformis 193 в ферментере иммобилизацией клеток в полиакриламидном геле со сшивающим агентом. Гранулы геля с иммобилизованной культурой используют для получения преднизолона, помещая их в реактор промышленного типа вместе с микрокристаллическим гидрокортизоном, дегидрирование осуществляют при коэффициенте заполнения 0,8 - 0,9 и перемешивании реакционной смеси циркуляцией через поверхность раздела фаз жидкость - воздух при определенных параметрах режима. Выход продукта повышается до 88%.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к промышленному получению преднизолона. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что трансформацию микрокристаллического гидрокортизона осуществляют в биореакторе промышленного типа при коэффициенте заполнения его реакционной смесью до значения 0,8-0,9, перемешивание реакционной смеси проводят путем циркуляции ее потока через образованную в биореакторе поверхность раздела фаз жидкость - воздух с расходом 1 объем реакционной смеси в 1 мин, создавая тем самым аэрацию и исключая попадание нерастворенного воздуха в циркулирующий поток, газообмен проводят в наджидкостной полости биореактора путем ее наддува воздухом до давления 0,05 МПа с последующей его декомпрессией до давления 0,01 МПа с частотой 1 имп/мин, а выделенный фильтрацией технический преднизолон, представляющий собой смесь преднизолона и остаточного гидрокортизона, обрабатывают реактивом Жирара Р, кристаллизуют и выделяют преднизолон фармакопейной чистоты. П р и м е р. Культуру A.globiformis 193 выращивают в ферментере, объемом 160 л (полезный объем 70 л) на кукурузно-глюкозной среде (глюкоза 1%, кукурузный экстракт 1%) в присутствии индуктора стероидной Δ^I-дегидрогеназы - ацетата кортизона, который вносят в среду вместе с посевным материалом в концентрации 20 мг%. Культуру выращивают в течение 24 с при перемешивании 180 об/мин и температуре 29^оС. Отделение биомассы от культуральной жидкости проводят на сепараторе ОСБ (г. Плавск). Отмытый от среды бактериальный осадок используют для приготовления суспензии клеток. Для этого клетки отмывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2) и готовят суспензию клеток 100 мг клеток (сухой вес) в 6 мл буферного раствора. Полученную суспензию иммобилизуют в 10%-ный полиакриламидный гель с 0,5%-ным содержанием сшивающего агента. Иммобилизацию проводят в мягких условиях: при температуре 40^оС в течение 1-2 мин, последовательно смешивая предварительно приготовленные растворы реагентов с суспензией клеток. Иммобилизацию проводят в камере из нержавеющей стали (толщина листа 1 мм). Объем полимеризационной смеси - 400 мл. Высота слоя жидкости не должна превышать 3 мм для обеспечения интенсивного охлаждения полимеризационной смеси. Для получения 5 л гранул необходимо провести семь полимеризаций. Гранулы геля с иммобилизованной культурой используют для получения преднизолона. Δ^I-дегидрирование гидрокортизона про- водят в биореакторе общим объемом 140 л с турбиной осевого действия. В биореактор вносят суспензию 500 г микрокристаллического гидрокортизона в 12 л стерильной водопроводной воды, 5 л гранул, содержащих 100 г клеток (сухой вес) и 88 л стерильной водопроводной воды, рН 7,2. Таким образом, коэффициент заполнения биореактора реакционной смесью равен 0,8. Соотношение субстрата и клеток в реакционной смеси составляет 5:1. Для осуществления аэрации наджидкостную полоcть биореактора соединяют трубопроводом с источником сжатого воздуха (компрессором), с помощью которого сначала создают наддув биореактора воздухом до давления 0,05 МПа, а затем сбрасывают этот воздух в атмосферу до остаточного давления в биореакторе 0,01 МПа. Наддув и сброс давления воздуха в биореакторе проводят с частотой 1 имп/мин на протяжении всего процесса трансформации гидрокортизона. Одновременно с аэрацией, реакционную смесь перемешивают турбиной, которую вращают с частотой 110 об/мин и термостатируют при 29^оС. При воздействии турбины в биореакторе образуется поток реакционной смеси с расходом 120 л/мин, который достигает фазового раздела жидкость - воздух, изменяет направление на 180^о и вновь попадает под действие турбины. Созданные условия перемешивания и аэрации препятствуют попаданию воздуха в поток реакционной смеси и не создают кавитационного разрыва реакционной смеси в зоне действия турбины, что полностью исключает пенообразование в процессе трансформации гидрокортизона, при этом достигается гомогенное распределение субстрата в реакционной среде. Анализ продуктов трансформации показал, что процесс трансформации микрокристаллического гидрокортизона ИК, при соотношении субстрата и клеток, равном 5: 1, протекает за 7-8 ч. В реакционной среде обнаруживается 88-90% преднизолона, 10-12% гидрокортизона и β-восстановленное производное преднизолона. По окончании трансформации реакционную среду сливают и отделяют от гранул на ситах. После удаления из ферментера реакционной среды ферментер и гранулы промывают. Для этого в ферментер заливают стерильную водопроводную воду и перемешивают. Через 5-10 мин воду сливают. Этим достигается одновременная промывка ферментера и гранул. Слитую реакционную среду подкисляют до рН 5,0 10%-ным раствором соляной кислоты с целью инактивации восстановительных ферментов, отфильтровывают суспензию преднизолона от культуральной жидкости, осадок промывают до нейтральной реакции водой, затем сушат при 80^оС в течение 4-5 ч. Таким образом, получают технический преднизолон, который содержит 10-12% остаточного гидрокортизона и 90% преднизолона.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА путем трансформации микрокристаллического гидрокортизона иммобилизованными в полиакриламидный гель клетками A.globiformis в реакционно-жидкостной среде с перемешиванием и аэрацией, и выделения целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, трансформацию гидрокортизона проводят в биореакторе промышленного типа при коэффициенте заполнения 0,8-0,9, перемешивание осуществляют циркуляцией реакционной смеси через поверхность раздела фаз жидкость-воздух с расходом 1 объем реакционной смеси в 1 мин, а газообмен - при градиенте давления 0,04 МПа.