Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к интерлейкину-2 человека

 

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Цель изобретения - создание нового более доступного штамма гибридных клеток - продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину-2 человека, обеспечивающего более высокий уровень биосинтеза МА с высокой константой связывания. Штамм гибридных клеток ЛНКБ-2 получен от слияния миеломных клеток X63 AG 8 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом рекомбинантного интерлейкина-2. Слияние проводят полиэтиленгликолем 4000, содержащим 10 об.% диметилсульфоксида. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 128Д. Концентрация МА в культуральной жидкости 75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа связывания антител с 1L2 составляет 3<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">8</SP> М<SP POS="POST">-1</SP>. МА, продуцируемые штаммом, связываются как с гликозилированным, так и рекомбинатным интерлейкином-2, а также пептидом, соответствующим последовательности аминокислот интерлейкина-2 человека 59-72. Получаемые МА являются иммуноглобулинами класса G2B. МА используют для определения интерлейкина-2 в биологических жидкостях и бактериальных лизатах.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Р .ЩЦ 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Первую иммунизацию проводят IL 2 в полном адъюванте Фрейнд (10 мкг внутрибрюшинно и 10 мкг подкожно в область лимфоузлов), вторую и третью иммунизации — по 20 мкг внутрибрюшинно в неполном адъюванте Фрейнда. . Через 10 дней проводят бустирование

10 мкг IL 2 в физиологическом растворе (внутрибрюшинно), Через четыре дня после бустирования мышь забивают, Селезенку забирают асептически, переносят в чашку Петри и перфузируют средой, для чего в селезенку вводят в несколько точек иглы и нагнетают

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4297479/28-13 (22) 14.08.87 (46) 15.04.89. Бюл,N 14 (71) Институт биоорганической химии им, М.N.Øåìÿêèíà (72) IО.А.Овчинников, В.Е.Лунев, . В.А.Несмеянов, Н .В .Казенных, С.В,Беляев, Ю.А.Циманис, Л.В.Оноприенко и И.И.Михалева (53) 578.085,23(088,8) (56) Cousin M.A. et al in J."Lymphokines Research", 4, 319, 1985. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS MUSCULUS1 ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИНТЕРЛЕИКИНУ-2

ЧЕЛОВЕ КА (57) Изобретение относится к областииммунологии и биотехнологии. Цель изобретения — создание нового более доступного штамма гибридных клеток— продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину-2 человека, обеспечивающего более высокий уровень !

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, Цель изобретения — создание нового более доступного штамма гибридных клеток — продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину 2 человека, обеспечивающего более высокий уровень биосинтеза MA с высокой константой связывания.

Штамм получают следующим образом.

Мьппь линии ВЖВ/с иммунизируют препаратом рекомбинантного интерлейкина 2 (II. 2) в течение 6 недель

3 раза по 20 мкг. биосинтеза МА с гысок1 константой связывания, Штамм гибридных клеток

ЛНКБ-2 получен от слияния миеломных клеток Х 63 Ая 8 653 со сплепоцитами мыши, иммунизированной препаратом рекомбинантного интерлейкина-2. Слияние проводят полиэтиленгликолем

4000, содержашим 10 об.Ж диметилсульфоксида. Штамм депонирован под номером BCKK(II) У !28Д. Концентрация

МА в культуральной жидкости

75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа связывания антител с IL 2 составляет 3 x10 M . 1М, продуцируемые штаммом, связываются как с гликолизи= рованным, так и рекомбинатным интерлейкином-2, а также пептпдсм, соответствующим последовательности аминокислот интерлейкина-2 человека

59-72. Получаемые МА являются иммуноглобулинами класса G2 В. IIA использу-ют для определения интерлейкина-2 в биологических жидкостях и бактериальных лизатах.

147 2499 под напором среду. Клеточную суспензию переносят в пробирку и позволяют нераэбившимся комочкам клеток рсесть в течение 2-3 мин. Клеточную суспен5 зию декантируют в другую пробирку и центрифугируют (200 хя, 10 мин) при комнатной температуре, Затем

30Х10 селеэеносных клеток мыши и 6"

<10 миеломиых клеток X663 Ag 8 653 смешивают в пробирке и промывают средой RPMI-1640. Надосадочную жидкость осторожно удаляют и при помешивании к клеточному осадку медленно, по каплям, в течение 30 с добавдяют 1 мл 15

50Х-ного раствора полизтиленгликоля

4000 с 10 по объему диметилсульфок-. сида в среде RPMI-1640. Через одну минуту для разбавления полиэтиленгликоля по каплям приливают 10 мл 20

RPMI 1640, Клетки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют (200 xg, 10 мин), Надосадочную жидкость декантируют, к осадку добавляют 40 мл RPMI 1640, со- 25 держащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), суспендируют клетки пипетированием и клеточную суспензию распределяют в четыре 96-луночные плашки, в которые за день до слияния 30 высаживают мышиные перитонеальные клетки (5x10> клеток на лунку). На следу-1 ющий день в лунки плашки вносят по

100 мкл среды, содержащей 2 «10 " M гипоксантина, Ях10 М аминоптерина и 35

3,2 «10 М тимидина, Клоны гибридных клеток становятся заметными через 710 дней. Тестирование клонов проводят, когда клетки заполняют лунку на 20Х.

Положительные культуры клонируют ме" тодом лимитирующих разведений при плотности 0,1-1 клетка на лунку.

Полученный штамм обозначен ЛНКБ-2.

Он депонирован под номером ВСКК(П)

11 128Д и характеризуется следующими 45 признак ами.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования: среда RPMI-1640, 300 мг/мл Lглютамина, 10 ЭТС, 5 «10 . M меркаптозтанола. Температура 37 С, При суспензионном культивировании клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаются свободно, При посевной плотности 1 xl0 -5 «104 кл/мл через 3-5 дней плотность достигает 3--10>10 кл/мл. Кратность рассева 5-, 5

10 раз.

Культивирование в организме животных. Гибридные клетки прививают и выращивают в виде асцита в перитонеальной полости мышей линии BALB/с.

3а 7 дней до введения клеток мышам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 10-14 дней после введения 2-5 млн. клеток.

Продуктивность штамма.

Концентрация специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкос-. ти — 5 — 10 мг/мл.

Характеристика полученного продукта. 111тамм продуцирует Ig С субкласса

2Ь. В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии .Jurkat, рекомбинантного IL 2 и синтетическим пептидом,,соответствующим последовательности аминокислот 59-72 интерлейкина 2 человека.

Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пас" сажей в культуре.

Криоконсервирование.

Среда для замораживания — 90 ЭТС, 10Х ДМСО. Плотность клеток 1"5

«10 кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке выдерживают при минус — 70 С в течение суток и переносят в дюары с жидким азотом. Режим отогрева — водяная баня при 37 С.

Жизнеспособность клеток после криоконсервирования 40 по окрашиванию с трипановым синим.

Конт аминация. Конт аминации отсутствуют.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Йммуноферментный анализ моноклональных антител ЛНКБ-2.

Образцы, содержащие антитела (супернатанты клеточных культур или асцитная жидкость), тестируют методом твердофазного иммуноферментного ана пиза по связыванию с препаратами

IL 2 из клеточной линии Jurkat (удельная активность 8,7 «10 ед./мг белка), рекомбинантного IL 2, пептидом, соответствующим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека. В лунки 96-луночной планки вносят препарат IL 2 (50 нг на лунку) яли пептид (500 нг/лунку) в 0,05 M бикарбонатном буфере рН 9,6 и остав-пяют на 18 ч при 4 С. Плашку отмывают О, l -ным раствором твина-20 в

0,01 М натрийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaC1 (ФСБТ), рН 7,2, и инкубируют с 200 мкл l .-ного раствора

5 бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 37 С. Плашку снова отмывают ФСБТ и вносят в лунку по 100 мкл препарата, содержащего антитела, После инкубации в течение одного часа при 37 С плашки отмывают

ФСБТ и обрабатывают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (100 мкл на лунку, разведение 1:1000, 1 ч 37 С). Плашку еще раз отмывают и вносят 100 мкл раствора ортб-фенилендиамина (1 мг/мл) в 1%-ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем

0,05 Н О . Реакцию останавливают через 15 мин добавлением 100 мкл на лунку раствора 2М серной кислоты.

Отрицательным контролем служат лунки плашки, не содержащие IL 2, а также лунки, в которые вместо антител к IL 2 25 вносят нормальный иммуноглобулин мыши.

Пример 2. Получение и очистка моноклональных антител.

Получение и очистка ЛНКБ-2 антител иэ культуральной и асцитной жид- 30 кости

1ибридные клетки наращивают в пластиковых матрасах в среде, RPMI

1640, содержащей 10% 3ТС 300 мг/л

L-глутамина и 5 «1О M меркаптоэтано ла При посевной плотности 5»

ЧО кл/мл через пять дней плотность достигает 1, 10 кл/мл. Культуральную жидкость с максимальной продукцией иммуноглобулинов (75 мкг/мл) получают от клеток в стационарной фазе роста (седьмой день). Очистку иммуноглобу линов проводят на протеин А-сефарозе

4В:.культуральную жидкость (200 мл), рН которой доводят до 8,2, наносят на колонку объемом 5 мл. Колонку промывают 0,01 М натрийфосфатным буфе-. ром, содержащим 0,15 М хлористого натрия (ФСБ), рН 8,2, и элюируют специфически адсорбировавшийся иммуноглобулин 0,1 M цитратом натрия с

О, 15 М ИаС1, рН 3 ° 5. Элюат сразу нейтразируют IM раствором трис-НС1, рН 8, 1. Раствор иммуноглобулинов

55 концентрируют до 3 мг/мл и диализуют против ФСБ, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореэа в 10 полиакриламидном геле в присут5 1472499

6 ствии додецилсульфата натрия. Выход

70 мг на 1 л культуральной жидкости, При получении иммунсглобули»ов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитонеальной полости мышей линии. ВАЬВ/с.

За 7 дней до инъекции клеток мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Асцитную жидкость забирают, через 14 дней после введения 4"

<10 клеток на мышь, С одной мыши получают 6 мл асцитной жидкости, После отделения клеток центрифугированием (400 xg) асцитную жидкость разбавля.ют до концентрации белка 10 мг/мл и проводят высаливание 40 -ным сульфатом аммония (2,4 г сульфата аммония на 10 мл разбавленного асцита). Осадок отделяют центрифугированием (10000 xg 30 мин), растворяют в

ФСБ, рН 8,2 и диализуют против этого же буфера. Дальнейшую очистку проводят на протеин А-сефарозе по описанной схеме. Выход гомогенного по данным электрофореза в полиакриламидном геле иммуноглобулина составляет 5 мг из 1 мл асцитной жидкости.

Определение концентрации ЛНКБ-2 антител в культуральной и асцитной жидкостях, В лунки 96-луночной плашки вносят по 250 нг кроличьих антител к Ig С мыши в 0,05 М бикарбонатном буфере, рН 9,6 и инкубируют 18 ч при 4 С, Лунки плашки, отмывают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (1 ч, о

37 С) ..После отмывки лунок ФСБТ по плашке раститровывают образцы (100 мкл), содержащие моноклональные антитела, и инкубируют в течение 1 ч о при 37 С, затем лунки плашки отмывают ФСБТ и вносят 100 мкл кроличьих антител к Ig G мыши, меченных пероксидазой хрена. Далее ИФА проводят как описано в примере l. В качестве стандарта используют нормальные мы.шиные иммуноглобулины. Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости составляет 75 мкг/мл.

Концентрация иммуноглобулина в асцитной жидкости составляет 8 мг/мл, Определение константы связывания

MA ЛНКБ-2 с IL 2 и с пептидом, соответствующим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека, Константу связывая»н определяют с помощью ИФА по уран»ени К =! 472499

1/(4 МАВ -2МАВ), где MAB — концентрация антител, соответствующая 50% связыванию от максимального, МА — концентрация антител, соответствующая 5

50% связыванию от максимального в случае нанесения на плашку вдвое меньшего количества антигена, На лунку плашки наносят соответственно

100 и 50 нг IL 2 или 500 и 250 нг 10 пептида 59-72, ИФА проводят как в примере 1. Константа связывания анти" тел с П. 2 составляет 3 «10 М а с петидом 9x10 M

Пример 3. Взаимодействие моноклональных антител ЛНКБ-2 с пептидом, соответствующим последова" тельности аминокислот 59-72 2 человека.

Пептид Leu-Glu-Glu-Glu-1еп-Lys- 20

-Р r o-Le u- Gl u- Gl u- Va 1-Le u- Аз п-1.eu, соответствующий последовательности 59-72 интерлейкина 2 человека, получен классическими методами пептидного синтеза в растворе. Гомогенность 25 конечного продукта доказана аминокислотным. анализом, тонкослойной хроматографией, и-ЯМР спектрами.

Взаимодействие ЛНКБ-2 антител с пептидом 59-72 проверяется в твердофазном конкурентном иммуноферментном анализе. На плашку наносят IL 2 (100 г/лунку) в 0,05 М бикарбонатном, буфере с рН 9,6 в течение 18 ч при

4 С. После промывки и пассивирования

35 плашки (пример 1) в лунки вносят

100 мкл раствора антител (5 мкг/мл) в ФСБ с 1%-ным БСА и пептидом в дво-., ичных разведениях, т.е. проводят конкуренцию антигена, иммобилизован ного на плашке, с пептидом в растворе за связывание с антителами ЛНКБ2). ИФА далее проводят, как в приме/ ре 1, Пятидесятипроцентное ингибирование связывания антител с IL 2 наблюдается при концентрации пептида

0 5 мкг/мп.

Таким образом, ЛНКБ-2 антитела специфически узнают последовательность аминокислот 59-72 IL 2 челове-..

50 ка.

Пример 4. Использование моноклональных антител ЛНКБ-2 для опре . деления П. 2, 55

Культуральный супернатант (1,5 л), полученный в результате стимуляции

I клеток линии Jurkat (2 x1 0 < кл/мл) конканавалином А (20 мкг/мл) и 4/з-форбол-12р-миристат-131-ацетатом (10 нг/мл), концентрируют ультрафильтрацией до объема 150 мл и высаливают сульфатом аммония (84 г). Оса" док растворяют в 5 мл 0,01 И фосфат-. ного буфера, содержащего 0,15 M хло-, ристого натрия и 0,1% полиэтиленгликоля 6000, рН 7-,2 (ФСБП), и наносят на колонку (2,5<90 см) с ультрагелем

АсА 54. Активные фракции объединяют, наносят на колонку с голубой сефароsoA CL — 6В (10 мл) и колонку промывают ФСБ, Сорбировавшиеся белки элюируют градиентом хлористого натрия от 0,15 до 1 N.

После проведения гельфильтрации и деления на голубой сефарозе, каждую фракцию тестируют в биологическом тесте (в разведении 1:10) и в твер" дофазном иммуноферментном анализе (100 мкл из каждой фракции вносят в плашку, далее пример 1). Биологиче" скую активность IL 2 определяют с помощью IL 2 — зависимой линии цито; токсических Т-лимфоцитов мыши. Уровень пролиферации оценивают путем окрашивания клеток 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий" бромидом. Количественную оценку ocy : ществляют сравнением тестируемых образцов IL 2 с международным стан-: дартом (BRHP Reference reagent, 13,i>10 ед,/мг).

Иммуноферментное и биологическое тестирования дают одинаковые профили элюирования IL 2.

Таким образом, использование штамма гидридных клеток ЛНКБ-2 позволяет получить моноклональные антитела к

2 человека; штамм-продуцент явля-. ется более продуктивным (на 33%), чем известные; продуцируемые этим штаммом МА отличаются от известных более высокой константой связывания и для них установлен участок связывания на молекуле -ХЬ 2.

Формула из обретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II)

N 128Д, используемый для получения моноклональных антител к интерлейкину-2 человека.