Способ получения антисыворотки к @ -эндотоксину н1 вас.тнuringiеnsis
СОЮЗ СОВКтСНИХ
СОЦИАЛИСТ1 1ЕСН11Х
КСГ1уБЛИм (19) 111) (51) 5 А 61 К 39/02
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 07.09.91, Бнзл . V 33
Аспорогенный штамм Bacillus thuringiensis var.thuringiensis 2-8 получен обработкой клеток штамма В.thuringiensis var. thuringiensis 202 новобиоцином — специфическим ингибитором ДНК-аэы.
Предлагаемая культура характеризуется следующычи свойстваии.
Штамм Bacillus thuringiensis var.
thur1ngiensis 2-8 — аспорогенная культура для упрощения способа и повышения выхода и чистоты кристаллического белка для получения антисы-воротки к Р -эндотоксину Н1. раиитrPCygAPCTBEHHblA KOMHTET
llo изоБРетениям и OTHpblTHRM
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4290576/14 (22) 27.07.87 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) Л.В.Кузина и А.Л.Андреева (53) 612.015 (088 ° 8) (56) Ang В.I. et al, Appl and Environm Hicrobiol 1978, 36, Р 4, р.625-626. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЬ;ВОРОТКИ
К 13-ЭНДОТОКСИЕЕУ HI ВАС. TE1URINGlENSlS (57) Изобретение oTHocvTCH к микробиологии, а именно к промышленному производству препаратов для количественного и качественного определения кристаллического белка -эндотоксина.
Целью изобретения является упрощение способа, повышение выхода и чистоты антигена для получения антисыйоротки к Р -эндотоксину Н1. Для этого испольИзобретение относится к промышленной микробиологии и касается аспорогенного штамма Вас.thuringiensis var.
thuringiensis 2-8, используемого для получения антисыворотки к Р -эндотоксину Н1.
Цель изобретения — упрощение способа, повышение выхода и чистоты антигена для получения антисыворогки к(3 -эидотоксину Н1.
Поставленная цель достигается использованием аспорогенного штамма
Bacillus thuringiensis var.thuringiens is 2-8.
2 эован аспорогенный штамм Bac. thuringiensis аг. thuringiensis 2-8. Проводят выращивание культуры укаэанного штамма, смывание ее физиологическим растворсм, центрифугирование и растворение полученного антигена в натрий-карбонатиом буфере и 10 мМ дитио- трейтоле при рН 10,0, последующую иммунизацию кролика, забор крови и очистку антисыворотки. Способ позволяет упростить получение антисыворотки к Д -эидотоксину, повысить выход укаэанного антигеиа до 99Х по сравнению с прототипом (20-30Х), обеспечивает чистоту аитигена — полное отсутствие спор, тогда как у прототипа от 3 до 10i: спор. Изобретение может быть использовано в производстве средств контроля /3 -эндотоксина Вас.thuringiensis -эффективного средства для защиты растений от вредных насекомых.
1 »97799
)» 1<» < ||» )<)()»)1 "» j l s <1 111< "lь< )аlеllllf t
))1)кроа) ) я ни »)1<»< В!111)1 г н . тl)t;;1, к<7)1)fe)(tt»<>)t)t) номер В-36<)
Подl)11жн )H I p 1(»t)o))o)F:)»те)11>EIsft п(1. .1oч ка. Ряэм<. 1»)) (1,6-1,1() х (3,4--4, 5) мкм.
Марфолагической осабен))а<-.тью является отсутствие спср и абра.)ование одного-двух кристаллов н алнай клетке.
Кристалль) ромбовидной формы с четкими гpéíями о Р )эмc р кpècталзlОF) 2 0 ; х1,5 мкм.
Проверка штамма В. thurinf,ions is
var. thur in iens is 2-8 па H-антигену со специфической сьн)ороткай подтвердила принадлежность напученного мутаита К ПОдВИду ь17)ЗГ)ngiPnsiS МИКраскопия клеток t))7a )I)a В.thuringiensis чаг. tlturingiensis 2-8 с помощью фа- 20 зовоконтрастной микроскопии, а также результаты микроскопии ультратанких срезов подтверд))1)и от< угствие спор в клетках и в свободном состоянии.
Культуралы(ые и физиологические 25 признаки.
Харашо растет на полноценных питательных средах (мясопептоннам агаре и бульоне, агаре из рыбного гидролиэата, агаре на переваре Хоттинге- ЗО ра). Опт)сиальной средой для синтеза кристаллов является картофельный агар: 600 r картофеля и 1 г NaC1 на
1 л воды. На твердых средах образует сероватые колонии. Пигмент не выделяет. Поверхность ян г<ховатая. Суспензия клеток в воде равномерная. В ж)цепких питательных органических и минимальных солевых средах наблюдается помутнение и абра:)онание пленки и рыхлого осадка. Картофель ломтиками, рост обильный, с.ера-креманые колонии. Пигмент не обря )ует.
Молочный агар. Пептони-)ация частичная, 1Келтачный аг Ip ° РоcT умерен45 ньй(, лицетин усваивается слабо.
Отношение к ист чникам углерода.
Использует глюкозу, сахарозу, манно< зу, иальтозу, кукурузный и картофельный крахиал. Не усваивает манноэу, сорбит, лактоэу, ксилозу. факультативный азраб. Оптимальная температура раста 28-30 С. Оптиd мум рН 7,0-7,4.
П р и и е р 1. Способ получения аспорогенного штамма В. tl)urir)<,i<.nsi s 55 чаг. thuringiens is 2-8.
Для получения яспорогенного мутантв )птаииа В. tl)uringi< nsis ?02 клетки
> 1 < j « lii l;il »1) ),, : :«
10 кл/f»jt, вносили нонабиоцин дс> конft< )(Tpl))till):) мг« /."1
Для проверки на присутствие у отобранного клона, получи)ня» гo обозначение В. thur. i)71;i< )Is is 2-8 клеток, содержащих споры, этот клан ныращинали в дражжепалисахаридной среде в течение 72 ч при 30 С, прогревали пр)1 70" С
20 мин (эту температуру выдерживают толька споры) и высевали на МПА.
Паявлсние расrя )te наблюдалась, что дока.)ывало 1))07.-ную аспорогеннасть полученного мутянта. Полученный мутант В. thllril(1;i.e»s is var. th»)ringiепя is 2-8 стабильно сохранял свойствоо аспорагенности при псресевах.
Падде<>жинаетс я ()ри храп< ни» н виде
aera7 a7 »))))t rr клеток на среде М11А при (<
6 С в течение двух лет.
П р и и е р 2. Для получения антисыворотки к (3-эндотаксину Н1 аспорагенный штямм В.thurin8iensis 2-8 выращивали nd картофельном,агяре в теwe)j»e 5 дней. Биомассу смынали с агара раствором 0,857.-ного хлористого натрия и осаждали центрифугировянием при 4000 об/мин в течение 10-15 мин.
Осадок ресуспендировали в 0,05 M натрий-карбанатном буфере (рН 9,5) и
10 ))М дитиатрейтоле и оставляли на
<)
2 ч при 20 С. После выдерживания центрифугиравали при 6000 об/мин 15 мин, Полученный супернатант содержал чистый препарат растворенных кристаллов в концентрации 2,16 иг/мл.
Для иммунизации 2 кроликов использовали 1 мл раствора кристаллического белка в концентрации 1мг/мл.
Иммунизацию проводили по описанной ранее методике. Полученная антисываротка имела титр 1:16. Антисываротка была использована для определения антигена при анализе бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную
ДНК,в составе которой находятся I ене— тические детерминанты синтеза /3 †зндотоксина Н 1. Полученную антисыворотку
1- 1977 сутствук<т стадия (!тлел< »1!я р!!<:та<1Формул а и э о б р е т е н и я
Составитель A.Èàêàðîâ
Техред Л.Олийнык Корректор Н.Король
Редактор Л.Павлова
TI!1< (1Ж
Заказ 3723
Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113!335, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г.у кг(!во(!.
6.п<1!1!.зоввлп для v<>JII«Ie(тв нн< г(определения P —
В. thuringiensis var. tllurinpi< us is
620 М, используя известные иммунохимические методы.
Пример 3. Для получения антисыворотки К Р -эндотоксину Н1 штамм
В.thuringiensis 2-8 выращивали, как описано вьппе (пример 2). Биомассу смывали раствором 0,857-ного NaC1 и осаждали центрифугированием 15
20 мин при 4000 об/мин. Ресуспендировали осадок в 0,05 H натрий-карбонатном буфере (рН 10,5) и 10 мИ дитиотрейтоле. Далее процедура не отличалась oT onHcBHHoA B примере 2.
Результаты, полученнь!е в и!.мере 3, не отличались от результатов примера 2.
Таким образом, описанный способ позволяет упростить прг<цедуру получения антисыВоротки к (3-з!!лс<токсину, повысить выход антигена дп 997 по сравнению с прототипом (20-30Х), его
В. t huring iе! .s i в а r. th«r I n<; i eпв i я 2-8, Способ получения анти IID(lpoTKH к
Р-эндотоксину HI Вас.th»ringienяis, включающий выращивание культуры бактерий Вас.thuringiensis, смывание ее физиологическим раствором„ центрифугирование и растворение полученного антигена в натрий-карбонатном буфере и 10 мМ дитиотрейтоле при рН 10,0 с последующей иммунизацией кролика, забором крови и очисткой антисыворотки, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода антигена, в качестве выращиваемой культуры Вас.thuringiensis используют штамм Бас,thuringiensis 202-2-8 9 BKIIM В-3699.
