Способ определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах

 

Изобретение относится к медицине , в частности, к клинической биохимии, и может быть использовано для определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах. Цель изобретения заключается в повышении точности и чувствительности способа. Сущность изобретения состоит в том, что для определения активности простагландин-синтетазы тромбоциты из крови выделяют в цитратном буфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводят очистку [<SP POS="POST">14</SP>С] арахидоновой кислоты с помощью хроматографии на кремниевой кислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определением радиоактивно меченных простагландинов проводят разделение продукта от непрореагировавшего субстракта с помощью хроматографии на кремниевой кислоте. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) А1 (51)4 G 01 N 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4367340/28-14 (22) 21.01.88 (46) 07.09.89. Бюл. Р 33 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт общей и судебной психиатрии им. В.П. Сербского (72) Н.Г. Гелинг и М.Н. Макарова (53) 612.015 (088.8) (56) Stenson W.F., Lobos Е., Biochem.

Pharmacol, 1983, v. 32, У 14, рр. 2205-2209. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ПРОСТАГЛАНДИН-СИНТЕТАЗЫ В ТРОМБОЦИ ТАХ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и может быть использовано для определения активности простагланИзобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и может быть использовано для определения активности простагландин (ПГ)— синтетаэы в тромбоцитах (ТЦ).

Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа.

Цель достигается тем, что взятие крови проводят с цитратным буфером рН 4,5 и обогащенную ТЦ плазму доводят до рН 6,5 для повышения устойчивости ТЦ к процедурам вьщеления; вводят временной интервал выдержки ТЦ (не менее 1 ч ) для восстановления их реакционной активности; непосредственно перед инкубацией проводят колоночную хроматографии для очистки (С j аsрахидоновой кислоты

1,АК 1 т образующихся при хранении дин-синтетазы в тромбоцитах. Цель изобретения заключается в повышении точности и чувствительности способа, Сущность изобретения состоит в том что для -определения активности простагландин-синтетазы тромбоциты нз крови вьщеляют в цитратном буфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводят очистку (4С ) арахидоновой кислоты с помощью хроматографии на кремниевой кислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определением радиоактивно меченых простагландинов проводят разделение продукта от непрореагировавшего субстрата с помощью хроматографии на кремниевой кислоте. 2 табл. перекисных соединений, обладающих ингибирующим влиянием на активность

ПГ-синтетаэы; инкубацию проводят в оптимальных условиях при рН 7,4 для повышения синтеза ПГ изолированными

ТЦ; образованные ПГ отделяют колоночной хроматографией от непрореагировавшего субстрата для устранения фонового загрязнения хроматографической пластинки меченой АК.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь отбирают в пластиковые пробирки с.цитратным буфером рН 4,5 (иэ расчета 1:9 по объему). содержашим 85 мМ цитрата натрия, 65 мМ лимонной кислоты и 58 мМ декстрозы.

Для удаления лейкоцитов и эритроцитов

3 !506358 кровь центрифугируют в течение 10 мин при 200 g. Обогащенную ТЦ плазму переносят в чистые пробирки, подкисляют 0,15 М лимонной кислотой до рН

6,5 (0,025 мп на 1 мл плазмы)и центрифугируют в течение 10 . н при 1000 . Осадок ТЦ ресуспендируют в модифицированном Тирод-Хепес-буфере рН 6,5 (137 мМ NaC1, 2,68 мМ КСI; 0,416 мМ 1О

КН Р04, 1 мМ М С1, 5 мМ декстрозы, 10 мМ HEPES> 0,353 БСА; 50 ед/мп гепарина; 0,05 мг/мл апиразы). ТЦ повторно осаждают при 800 g в течение

10 мин, ресуспендируют в безкальциевом Тирод-Кепес-буфере рН 7,4 без

БСА, гепарина и апиразы (в 1/5 от исходного объема} и осуществляют просчет ТЦ под микроскопом или с помощью соответствующего гематологи- 20 ческого анализатора, Исследование проводят не ранее чем через 60 мин после получения конечной суспензии ТЦ (примерно через 2,5 ч с момен:а взятия крови ). В день проведения 25 эксперимента соответствующее количество (+С 1 АК выпаривают под азотом, растворяют в 0,1 мп хлороформа (хлф) и наносят на колонку, заполненную

0,5 r кремниевой кислоты (,ОJ-200 меш)30 в 1 5 мп хлф L " "С j АК, количественн0 элюируют 7 л хлороформа, выпаризамт под азотом и растворяют в таком количестве 0,05 Й Трис-НС1-буфе1 ",р11 8 ), чтобы .получить 5 нмоль

AK в 0,05 мл буфера. Инкубапию проводят в течение 10:1ин при 37 С, кон— ценrp öèè ТЦ 2 «1О, АК 5 мкМ в Объеме 1 п. Реакция начинается с момендс.баьления (4 С ", АК, идет при пос- 40 тояннсм перемешигании и останавливаетс., добавлением охлажденной на льду смеси хлф: метанол: 17. муравьиная кислота (1, 2: 1,2: О, 1) из расчета

2,5 объема на 1 объем реакционной 45 смеси. Нижнюю хлф, фазу выпаривают под а:отом и растворяют в 0,1 мл хлф.

В к честве контроля проводят инкубацию (С 1 AK (5 мкР) в отсу-ствии ТЦ.

Хлф ° экстрак г (О q 1 мп) наHocRT на колонку с кремниевой кислотой. Сначала элюируют непрореагироьавшую (ИС)

АК 7 мп хлф, а затем с C j ПГ 5 мп

20Жного метанола в хлЛ. Сконцентрированный под аз отом злю ат П1 нано 55 сят на хроматографическую пластинку

"Silufol" (ЧССР) совместно со стандартными Пà — тромбоксан В, (ТХВ ), ПГЕ и ПГР „и разделяют в системе

4 диэтиловый эфир: метанол:ледяная уксусная кислота (90:1:2). г

Пятна на пластинках, соответствующие стандартным ПГ, проявляют в парах иода, вырезают и помещают в сцинтилляционные флаконы. После экстракции ПГ метанолом добавляют сцинтилляционную жидкость и просчитывают радиоактивность на р-счетчике. Активность ПГ-синтетазы оценивают по количеству нмоль ПГ, синтеэируемых

ТЦ из меченого субстрата за 10 мин инкубации, в расчете на определенное количество ТЦ (10 ).

Пример l. 12 мл крови смешивают с 1,1 мп цитратного буфера рН

4,5 и центрифугируют в течение 10 мин при 200 g. В чистые пробирки переносят 3 мл обогащенной ТЦ плазмы, добавляют 75 мкл 0,15 М раствора лимонной кислоты и центрифугируют при

1000 g в течение 10 мин. Осадок ТЦ ресуспендируют в 1 мл Тирод-Хепесбуфера рН 6,5 (с гепарином, БСА апиразой) с последующим доведением о 3 мл. ТЦ повторно центрифугируют при 800 g в течение 10 мин, ресуспендируют в 0,6 мл Тирод-Хепес-буфера рН 7,4 и 40 мкл суспензии отбирают цля просчета концентрации ТЦ на гематологическом анализаторе "СЕЗШ-Дин"

Э (Италия). После разбавления пробы

160 мкл физиологическим раствором получают в 1 мп анализируемого раствора 2,9 «10 ТЦ. Из флакона с исходным

8 раствором (С ) АК (54,9 мКл/ммоль) в стеклянную силиконированную пробирку отбирают ll мкл кислоты, выпаривают под азотом, растворяют в 0,1 мл хлф и наносят на колонку с 0,5 r кремниевой кислоты (100-200 меш. »о

Rad Lab. США), суспендированной в

1,5 мл хлф " С ) АК, элюируют 7 мл хлф, 0,1 мп элюата отбирают в сцинтилляционный флакон, выпаривают, добавляют 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8. После просчета радиоактивности получают 34 800 раси/MHH °

С учетом этих данных оставшийся хлф. элюат выпаривают под азотом и растворяют в 1,97 мл 0,05 М Трис-HCI. Для проведения реакции в пробирку добавляют 0,138 мл суспензии ТЦ (2 10 8 ТЦ)

0,812 мл 0,05 M трис-НСI буфера рН

7,4. После помещения в водяную баню (37 С) вносят 0,05 мл 4 С 1 АК (5 нмоль) и через IO мин 2,5 мп охлажденной смеси хпф:метанол. 17-ная муТаблица!

Активность

ПГ-синтетазы 40 (нмоль на

I0 ТЦ) Количество распадов в

ПГ мин

Опыт Контроль

5 15063 равьиная кислота в соотношении 1,2: 1,2:

:0,1. Для контроля проводят инкуба цию с » С j АК в отсутствии ТЦ. Нижнюю хлф.фазу выпаривают под азотом т растворяют в 0,1 мп хлф. и наносят на колонку с кремниевой кислотой (0,5 r), суспендированной в 1,5 мп хлф. Непрореагировавшую 1 "» С ) — АК элюируют 7 мл хлф, а Пà — 5 мл 20%ного метанола в хлф. Выпаренную до 0,05 мп ПГ фракцию наносят на хроматографическую пластинку Silufol (15 15 см, ЧССР) вместе с ПГЕ<, ПГР и ТХВ (по 10 мкг каждого). Пластин- 15 ку помещают в хроматографическую камеру с 50 мп системы растворителей диэтиловый эфир: метанол: ледяная уксусная кислота (90:1:2) и после трехкратного хроматографирования вы- 20 сушивают и проявляют в парах иода.

Получены следующие значения Rg для

ТХВ 0,64; III E> 0,33, ПГР 0,23.

Пятна на пластинке, соответствующие стандартным ПГ, вырезают, поме- 25 шают в сцинтилляционные флаконы н после экстракции ПГ 0,1 мл метанола добавляют 10 мл сцинтиллятора ЖС-8.

Просчет радиоактивности проводят на р-счетчике "Mark-111" (Нидерланды). 30

После соответствующего пересчета идентифицированной радиоактивности (распады в мин) в активность ПГ-син— тетазы (нмоль ПГ на 10 Т!() получили следующие данные, представленнь е в табл.l, 58 6 синтезирующего фермента в ТЦ. В конт" рольном опыте получены дюновые значения радиоактивности (не выше

80 расп/мин), что соответствует количеству ПГ не более чем 0,003 нмоль на

I0 ТЦ и входит в ошибку разброса, результатов данного опыта.

Пример 2. Выделение изоли" рованных ТЦ и очистку меченого субстрата осуществляют по примеру 1, снижая при инкубации рН до 7,0 (используют те же ТЦ и Г С J — АК). В реакционную пробирку добавляют 0,138 мп суспензии ТЦ (пример 1 ) и 0,812 мп

0,05 И Трис-НС! буфера рН 7,0. Пос-. ле помещения в водяную баню (37 С) вводят (и С j АК и через 1О мин

2,5 мп охлажденной смеси хлф:метанол: 1%-ная муравьиная кислота (1,2:

:1,2-0,1!. Последующие процедуры экстракции, очистки образованных ПГ от непрореагировавшего субстрата, разделения метаболитов ТСХ и просчет радиоактивности проводят по примеру 1. Активность ПГ-синтетаэы в этих условиях равна 1,67 нмоль ТХВ1 на

10 ТЦ (44533 расп/мин радиоактивности в соответствующем пятне хроматографической пластинки ), что состав" ляет 6,7% от количества добавленного субстрата. Небольшое (на 20% ) сни-. жение активности ПГ-синтетазы ТЦ при рН 7,0 связано со смещением оптимального для работы этого фермента рН

7,4 в сторону преимущественного образования в ТЦ липооксигенаэного иетаболита АК, С уменьшением рН инкубационной среды с 7,4 (пример 1) до 7,0 отмечается незначительное снижение синтеза и других ПГ:F. с 0,21 до О,17 и,, с О,О8 до О,О7 Hìo на 10 ТЦ.

„45

2,09

0,2!

0,08

ТХВ 55838 80

ПГЕ 5622 64

ПГЕ 2098 67

Таким образом, изолированные ТП превращают (4С ) — AK главным образом в ТХВ (2,09 нмоль на !О Т11, 8,4% от количества добавленного субстрата или 88% от общего образования

ПГ ) и небольшие количества ПГЕ< и

ПГР, (0,33 и 0,07 нмоль на 10 ТЦ соответственно) . По образованию ТХВ, как ocHoBHoro метаболита АК в Т1(, следует удить об актиьности ПГ—

Пример 3, Выделение ТЦ и инкубацию с (С ) AK проводят по примеру 1. При этом используют те же

ТЦ, но неочищенную от примесей (Cj

AK (2 75 мкл исходного раствора (С)

AK добавляют при инкубации в опытную и контрольную пробы ). Условия проведения инкубации, последующая экстракция и ТСХ анапогичны описанным.в

I примере 1, Перед проведением ТСХ не проводят очистку образованных ПГ от непрореагировавшего субстрата.

Полученные данные представлены в табл.?..

1506358

Таблица2

Активность

ПГ-CHHTBTGSbl, нмоль íà 10>

ТЦ

Количество

ПГ распадов в мин

Контроль

Опыт

1,43

0,32

0,06

ТХВ Зф546 226

ПГЕ 6917 149

ПГР 1983 09

Формул а изобретения

Составитель А. Скурат

Техред N. Пидык

Корректор Э Лончакова

Редактор А. Козориз

Подписное

Тираж 789

Заказ 5423/46

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

В контрольном эксперименте при отсутствии очистки образующихся ПГ от непрореагировавшей (С ) АК в

51 зонах хроматографической пластинки, соответствующих стандартным ПГ (ТХВ, 20

ПГЕ и ПГР ),отмечены повышенные значения радиоактивности по сравнению с соответствующими значениями в контрольном опыте примера Р 1. Это указывает на фоновое загрязнение радиоактивным субстратом, проходящим через всю пластинку с фронтом растворителя и вносящим погрешность в измерение ПГ. В условиях данного эксперимента выявлено примерно 30Х сньакение синтеза ТХВ (по сравнению с соответствующими зйачениями в примере 1 ), что связано с использованием неочищенной (С ) АК, образующей при хранении перекиси, подавлякицие активность ПГ-синтетазы, Некоторое увеличение синтеза ПГГ > (на 163) может быть мнимым, так как уровень образования этого Пг достаточно низкий, и может быть обусловлено присутствием примеси непрореагировавшего субстрата.

Использование предлагаемого способа позволяет определять активность

ПГ-синтетазы с точностью до 95Х и чувствительностью не менее 1 нмоль анализируемых ПГ. Кроме этого, разброс показаний составляет менее !07 за счет использования интактных ТЦ и проведения инкубации в оптимальном для фермента режиме работы.

Способ определения активности простагландин-синтетазы в тромбоцитах, включающий выделение тромбоцитов, инкубацию (11 0 ) арахидоновой :

1 кислоты, экстракцию и тонкослойную хроматографию с последующим определением радиоактивности в зонах, соответствующих стандартным простагландинам, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, тромбоциты из крови выделяют в цитратном буфере при рН 6,5, выдерживают в течение 1 ч, предварительно проводят очистку (14С ) арахидоновой кислоты с помощью хроматографии на кремниевой кислоте, инкубируют ее с тромбоцитами при рН 7,4, а перед определением радиоактивно меченых простагландинов проводят разделение продукта от непрореагировавшего субстрата с помощью хроматографии на кремниевой кислоте,