Способ получения белков с мол.м. 32000-34000, подавляющих свертывание крови

 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии. Цель изобретения - повышение качества целевого продукта за счет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании. Для этого внутреннюю оболочку аорт или васкуляризованную ткань гомогенизируют в растворе 100 ммоль/л хлористого натрия, 50 ммоль/л гидрохлорида трис-(оксиметил)-аминометана, PH 7,5 (TBS), содержащем этилендиаминтетраацетат натрия, ингибитор трипсина из соевых бобов и бензамидин. Гомогенат центрифугируют 60 мин, при 100 000 G. Из надосадочной жидкости целевой продукт осаждают высаливанием сульфатом аммония. После центрифугирования при 10 000 - 12 000 G полученный осадок растворяют в малом объеме TBS, диализуют против TBS, содержащего бензамидин. Диализованную фракцию подвергают очистке с помощью хроматографии на гидроксиапатите, диализу, ионообменной хроматографии на сефацеле с диэтиламиноэтиловыми группами, повторному диализу. Полученную фракцию концентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны РМ-10. Дальнейшую очистку проводят либо хроматографией на сефадексе G-100 с последующим диализом, либо с помощью гель-фильтрации на суперозе-12, ионообменной хроматографии на анионите Моно Q и повторной гель-фильрации на суперозе-12 с последующим диализом. Изобретение позволяет добиться получения целевого продукта более высокого качества, который в отличие от получаемого в способе-прототипе антитромбина-Ш не вызывает инактивации фактора свертывания крови Хаитромбина и поэтому не приводит к склонности к кровотечениям при его использовании. Целевым продуктом являются белки с мол.м. 32000 и 34000 и значениями изоэлектрической точки при PH 4,4-4,6.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 А 61 К 37/02 ;. ЛМ г.(.йй I

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3957808/28-14 (22) 20.09.85 (3 1) 8402904 (32) 21.09.84 (33) NL (46) 30.09.89, Бюл. Р 36 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (1)Е) (72) Кристиан Петер Мария Ройтелингспергер (NI.) (53) 615.45(088.8) (56) Нао J,I., et al. Methods of Plasma Protein Fractionation. /Ed,J,M,Curling, .London ete: Academic Press, 1980, р. 62-64. (54) СПОСОБ ПОЛУЧБНИ Ч БЕЛКОВ С

M0JI. М, 3 2000-34 000, ПОДАВЛЯИЦИХ СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии. Цель изобретения — повышение качества целевого продукта за счет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании.

Для этого внутреннюю оболочку аорт или васкуляризованную ткань гомогенизируют.в растворе 100 ммоль/л хлористого натрия, 50 ммоль/л гидрохлорида трис-(оксиметил)-аминометана, рН 7,5 (TBS), содержащем этилендиаминтетраацетат натрия,ингибитор трипсина из соевых бобов и бензамидин.

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии, и может быть использовано для по2

Гомогенат центриАугируют 60 мин при

100000 g. Из надосадочной жидкости целевой продукт осаждают высаливанием сульфатом аммония, После центрифугирования при 10000 — 12000 g полученный осадок растворяют в малом объеме TBS диализуют против TBS содержащего бензамидин, Диализованную Аракцию подвергают очистке с помощью хроматографии на гидроксиапатите, диализу, ионообменной хроматограАии на сеАацеле с диэтиламиноэтиловыми группами, повторному диализу. Полученную

Аракцию концентрируют с помощью ультраАильтрационной мембраны PM-10, Дальнейшую очистку проводят либо хроматографией на сеАадексе С; †1 с последующим диализом, либо с помощью гель-Аильтрации на суперозе-12, ионообменной хроматограАии на анионите

Моно Ц и повторной гель-Аильтрации на суперозе-12 с последующим диализом, Изобретение позволяет добиться получения целевого продукта более высокого качества, который в отличие от получаемого в способе-прототипе антитромбина-10, не вызывает инактивации фактора свертывания крови Ха и тромбина и поэтому не приводит к склонности к кровотечениям при его использовании, Целевым продуктом являются белки с мол.мас. 32000 и 34000 и значениями изоэлектрической точки при рН 4,4-4,6. лучения белков с мол.м. 32000-34000, подавляющих свертывание крови.

3 !51247

Целью изобретения является ловьш ение качества целевого продукта за счет предотвращения склонности к кро вотечениям при его использовании.

На чертеже изображен профиль гель5

Аильтрации на сефадексе С-100, используемой на заключительной стадии очистки целевого продукта в примере 1.

Способ осуществляют следующим образомм.

Внутреннюю оболочку (интиму) аорт или васкуляризованную ткань гомогенизируют в растворе 100 ммоль/л NaCl

50 ммоль/л трис-НС1, рН 7,5 (TBS), со-15 держащем этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТЛ), ингибитор трипсина нз соевых бобов и бензамидин. Гомогенат центрифугируют в течение 60 мин при

100000 р. Из надосадочной жидкости целевой продукт осаждают с помощью высаливания сульфатом аммония. После центрифугирования при 10000-12000 g полученный осадок растворяют в малом объеме THS, диализуют против TBS,ñî- 25 держащего бензамидин. Диализованную

Аракцию подвергают очистке с помощью хроматбграфии »а гидроксиапатите, диализа, ионообменной хроматографии на сефацеле с диэтиламиноэтило- 30 выми группами (ДЕЛŠ— сефацеле), повторного диализа. Полученную фракцию, содержащую VAC-белки (vascular anticoagulant — противосвертывающее средство сосудистого происхождения),концентрируют с помощью ультраАильтрационной мембраны Arnicon PN-10.Дальнейшую очистку проводят либо хроматограАией на сефадексе G-100 с последующим диализом, либо с помощью гель-фильтрами ции на суперозе-12, ионообменной хроматограАии на анионите Моно Я и повторной гель-фильтрации на суперозе-12 с последующим диализом, Целевым продуктом являются белки с мол.м. 32000-34000, подавляющие свертывание крови, но отличающиеся по свойствам от получаемого в способепрототипе белкового антикоагулянта антитромбина-III.

Пример 1. В течение 30 мин после забоя у крупного рогатого скота берут аорты. Кровь крупного рогатого скота собирают с добавлением цитрата натрия трехзамещенного до конечной концентрации 0,38 вес.7. и центри- 55 фугируют в течение 10 мин при комнатной температуре 2000 g. Полученную плазму, содержащую небольшое ко3 4 личе ство тромбоцитов, центрифугируют в течение 15 мин при 10000 р, Таким образом получают плазму, свободную от тромбоцитов (PFP), которую используют для определения противосвертывающей активности Аракций, Непосредственно после сбора аорты животных тщательно промывают TBS. Интиму отделяют от аорты и гомогенизируют в гомогенизаторе типа Баун ИХ 32, в TBS с 2 ммоль/л ЭДТЛ (TBSE), который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и 1,57 г/л бензамидина, Гомогенат из 8 аорт, который содержит 207 (вес./объем) твердого вещества, центрифугируют в течение 60 мин при 100000 р, 1

В надосадочную жидкость добавляют порошок сульАата аммония до 307 от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют в течение 20 мин при 12000

В получаемую при этом надосадочную жидкость добавляют порошок сульАата аммония до 907. от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и центриАугируют в течение 20 мин при 12000 g. Полученный осадок растворяют в малом объеме TBS и подвергают диализу против TBS, содержащего 1,57 г/л бензамидина. Диализованную Аракцию подают на колонку (1 х х 20 CM) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена TBS. Колонку промывают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. VAC-белки элюируют из колонки 200 мл натрийфосфатного буфера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л. Фракции,содержащие VAC-белки, объединяют и подвергают диализу против 50 ммоль/л

NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 (трис-трис/оксиметил/-аминометан).Такой же буАер применяют также для уравновешивания колонки (Зх5 см), содержащей ДЕЛЕ-сефацель. В этой колонке диализат подвергают хроматограАии.Колонку промывают применяемым для уравновешивания буАером, который берут в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. Затем VAC-белки элюируют из колонки с использованием 200 мл раствора NaC1, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 с линейным градиентом NaC1

50-300 ммоль/л. Фракции, содержащие

ЧЛС-белки. собирают, диализуют про1э12473

5 тив 500 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 затем концентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны Amicon РМ-10, Концентрат объемом .

2 мл подают на колонку (3x80 см) с се5 факдесом G-100, которая была уравновешена 500 ммоль/л NaCl и 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5, Элюат собирают фракциями пс 2 мл, активные фракции, содержащие VAC-белки с мол.мас,32000 и 34000, диализуют против содержащего 10 об,% глицерина TBS и хранят о при -70 С. Rce стадии очистки провоо дят при 0-4 С.

Определение противосвертывающей активности содержащих VAC-белки фракций проводят следующим образом, В кювете из силиконизированного стекла перемешивают (900 об/мин)

175 мкл испытуемой фракции (или

175 мкл TBS в качестве контроля) вместе с 50 мкл PFP и 25 мкл разбавленного бычьего тромбопластина (БТР).

После инкубации в течение 3 мин при

37 С вызывают коагуляцию путем добавления 250 мкл буфера, который содержит 80 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л СаС1 и 10 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5. Образование фибрина регистрируют оптически.

Время свертывания контрольной пробы составляет 65 с. Это испытание применяют во время очистки для исследования различных фракций на наличие

VAC-активности. Для определения выхода VAC-белков во время очистки опре35 деляют единицу VAC-активности, как такое количество VAC-белков, которое удлиняет время свертывания при вышеуказанном испытании до 100 с.

В данном примере получены следующие результаты, 1.,Надосадочная жидкость после первого осаждения сульфатом аммония (30% от насыщения): 630 мг белка, 19500 ед. VAC-активности, удельная активность : 31,0 ед/мг; выход 100%; степень очистки 1 0.

2. Осадок после второго осаждения сульфатом аммония (90% от насыщения), 470 мг белка; 19000 ед. VAC-активности; удельная активность 40,4 ед/мг степень очистки 1,3.

3. Фракция после хроматографии на гидроксиапатите:

206 мг белка;

17300 уд. VAC-активности, 6 удельная активность 84,0 ед/мг; выход 89%, степень очистки 2,7, 4, Фракция после хроматографии на

ДЕАЕ-сефацеле: 35,8 мг белка;

13900 ед, VAC-активности, удельная активность 388 ед/мг, выход 71%; степень очистки 12,5.

5. Фракция после хроматографии на Сефадексе G-100:0,45 мг белка;

666 ед. VAC-активности; удельная активность 1480 ед/мг; выход 3,4% степень очистки 47,7.

Количество белка определялось по методу Lorry и сотр. (1951).

Пример 2. Через 15 мин после родов собирают человеческие пуповины. Артерии сразу же промывают ледяным буфером TBS, после чего гомогенизируют в гомогенизаторе типа

Браун ИХ 32, в TBSE, который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина иэ соевых бобов и 1,57 г/л бензамидина °

Гомогенат, который содержит 10% (вес/объем) твердого вещества, центрифугируют в течение 60 мин при

100000 g. В надосадочную жидкость добавляют порошок qульфата аммония до 30% от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют в течение 20 мин при 100000

Полученный осадок растворяют в малом объеме TBS и подвергают диалиэу против TBS, содержащего 1,57 г/л бензимидина. Диализованную фракцию подают На колонку (1х20 см) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена TBS.

Колонку промывают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки.

VAC-белки элюируют из колонки 200 мл натрийфосфатного буфера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л.

Фракции, содержащие VAC-белки, объединяют и подвергают диализу против

50 ммоль/л NaC1, 20 ммоль/л .трис/НС1, рН 7,5.

Такой же буфер применяют для уравновешивания колонки (Зх5 см),содержащей ДЕАЕ-сефацель. В этой колонке диализат подвергают хроматографии.

Колонку промывают применяемым для уравновешивания буфером, который берут в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. Затем VAC-белки

1512473 элюируют из колонки с использованием

200 мл раствора NaC1 в 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5, с линейным градиентом NaC1 50-300 ммоль/л. Фракции

5 содержащие белки-VAC, собирают, диализуют против 500 ммоль/л ИаС1, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 и затем концентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны Amicon PM-10, Концентрат объемом 2,мл подают на колонку (Зх80 см) с сеЬадексом G-100, которая была уравновешена 500 ммоль/л

NaCl и 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5.

Элюат собирают фракциями по 2 мл, активные Аракции, содержащие VAC-белки с мол,мас. 32000 и 34000, диализуют против содержащего 10 об,7 глицерина TBS и хранят при -70 С, Все стадии очистки проводят при 0-4 С.20

Пример 3. Получаемую непосредственно после родов человеческую плаценту охлаждают до 4 С и освобождают от крови. Удаляют мембранный материал и гомогенизируют в буфере TBS c рН 7,4, который содержит 1„57 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов, 1,6 г/л бензамидина и 1 ммоль/л

ЭДТА, Гомогенат, который содержит

20Ж (вес./объем) твердого вещества, центриАугируют в течение 60 мин при

100000 р. В надоев,--очную жидкость добавляют порошок су;.:ьфата аммония до ЗОБ от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и за35 тем центрифугируют в течение 20 мин при 10000 g.

Полученный осадок растворяют в малом объеме ТВ$ и подвергают диализу против ТВ$, содержащего 1,57 г/л бензамидина. Диализованную фракцию подают на колонку (1х20 см) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена TBS Колонку промывают TBS в количестве,соответствующем 4 объемам слоя колонки. 45

VAC-белки элюируют из колонки 200 мл натрийфосАатного буфера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л.

Фракции, содержащие VAC-белки, обьедипяют и подвергают диализу против

50 ммоль/л NaC1, 20 ммоль/л трис/НС1, 50 р!1 7 5.

Содержащие ЧАС-белки фракции подвергают дальнейшей очистке путем .разделения на колонке с ДЕАЕ-сефацелем, Колонка была уравновешена

20 ммоль/л трис/НС1 буфером с

50 ммоль/л хлористого натрия, рН 7,4, Связанные ЧАС-белки элюируют тем же буфером с 300 ммоль/л хлористого натрия, рН 7,4. Затем последовательно осуществляют при комнатной температуре следующие хроматографические операции:- гель-фильтрацию содержащих VAC-белки фракций на колонке с суперозой-12 (торговый продукт шведской Аирмы Фармация, который представI ляет собой сшитую агарозу с величиной частиц 10 мкм), которая была уравновешена буфером 20 ммоль/л бис-трис/НС1,, 100 ммоль/л хлористого натрия, рН 6,3, и ионообменную хроматограАию элюата на Моно О (торговый продукт шведской фирмы Фармация, который ITредставляет собой анионллт шариковой структуры с величиной частиц 10 мкм), который был уравновешен применяемым на предыдущей стадии буАером, Элюцию осуществляют с использованием линейного градиента хлористого натрия в 20 ммоль/л бис-трис/НС1, рН 6,3, ИС-белки элюируют при 190 ммоль/л хлористого натрия. Затем содержащие VAC-белки фракции подвергают повторной хроматографии на суперозе-12, После диализа против буАера TBS фракции, содержащие

VAC-белки с мол.ьРас.32000 34000, хранят при -70 С

Пример 4. В течение 30 мин после забоя у крупного рогагого скота берут аорты, 1!епосредственно после сбора аорты основательно промывают TBS, Интиму отделяют от аорты и гомогенизируют в гомогенизаторе типа Браун НХ 32, в

ТВ$Е, который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и

1,57 г/л бензамидина.

Гомогенат центрифугируют в течение

60 мин при 100000

В надосадочную жидкость добавляют порошок сульфата аммония до ЗО от насыщающей концентрации,, перемешивают в течение 30 мин и центриАугируют в течение 20 мин при 12000 g, Твердое вещество суспендируют в малом объеме

TBS и подвергают диализу против ТВ$, содержащего 1,57 г/л бензамидина.

Диализованную Аракцию подают на,олонку (1x20 cM) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена ТВ$. Колонку промывают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки, VACбелки элюируют из колонки 200 мл натрпйфосАатного буАера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 глмоль/л.

1512473

40

7,9+ 1;0

6,9+0,8

7,4+1,8

13,4+2,2

2,3 1,2

7,9 1,8

4,6+0,4

1,4+0,2

Asx

Thr

Ser

G1x

Pro

Gly

Аlа

Va1

Met

Содержащие VAC-белки фракции подвергают дальнейшей очистке путем раз деления на колонке с ДЕАЕ-сефацелем.

Колонка была уравновешена 20 ммоль/л . трис/НС1 буфером, 50 ммоль/л хлорис5 того натрия, рН 7,4.

Связанные VAC-белки элюируют с использованием 200 ммоль/л трис/НС1 буфера, 300 ммоль/л хлористого натрия,10 рН 7,4. Затем последовательно осуществляют при комнатной температуре следующие хроматографические операции: гель-фильтрацию содержащих VAC-белки фракций на колонке с суперозой-12ь ко 15 торая была уравновешена буйером

20 ммопь/л бис-трис/НС1, 100 ммоль/л хлористого натрия, рН 6,3, и ионнообменную хроматографию элюата на анионите Моно О, который был уравно- 20 вешен применяемым на предыдущей стадии буфером. Элюцию осуществляют с использованием линейного градиента хлористого натрия в 20 ммоль/л бис-трис/НС1, рН 6,3. VAC-белки элюи- 25 руют при 190 ммоль/л хлористого с натрия. Затем содержащие VAC-белки фракции подвергают повторной хроматографии на суперозе 12. После диализа против буфера ТВ$ фракции, содержащие VAC-белки с мол. мас.32000 и

34000 хранят при -70 С, Все стадии

У о очистки проводят при 0-4 С.

С помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии

35 додецилсульфата натрия установлено, что получаемая VAC-активность представлена двумя белками с мол.мас.

32000 и 34000.

Изоэлектрофокусирование при рН

3,5-9,5 в тонкослойных пластинах полиакриламидного геля показало, что

VAC -белки имеют значения изоэлектрической точки при рН 4,4-4,6, Аминокислотный состав обоих ЧАС- 45 белков, определяемый с помощью кислотного гидролиза, представлен в таблице (Trp не определялся).

6,5+.0,6

12,0+2,4

3,7 +0,4

3,7 10,6

6,5+ 1,2

1,4+0,8

5,6+2,0

Jle

Leu

Tyr

Phe

Lys

His

Arg

При хранении в TBS, содержащем

10 об.Х глицерина, VAS-активность стабильна по крайней мере в течение

3 мес при -70 С, при 0 С вЂ” по крайней мере 12 ч, при 37 С вЂ” по крайо ней мере 30 мин, При 56 С активность исчезает в течение 2 мин.

Получаемый в способе-прототипе антитромбин-III приводит к увеличе" нию склонности к кровотечению, что обусловлено тем, что он связывается с активированными факторами свертывания крови, в результате чего имеет место их инактивация. Получаемые же

По своей биологической активности VAC-белки могут быть охарактеризованы следующим образом: — они тормозят активацию протрайбина с помощью фактора свертываемости крови Ха в присутствии отрицательного заряженных фосфолипидов и ионов Са

I — они не тормозят биологическую и амидолитическую активность факторов

Ха и Па, — они тормозят хп vitro активацию фактора Х по внутреннему пути с помощью фактора ЕХа в присутствии отрицательно заряженных Лосфолипидов и и ионов Са ; они тормозят in vitro индуцированное стенкой сосуда свертывание крови; — они вытесняют фактор Ха и протрамбин из комплекса с отрицательно заряженной поверхностью фосфолипидов; — они удлиняют тромбиновое время, определенное модифицированным методом; — они удлиняют активированное, частичное тромбопластиновое время, определенное модифицированным методом; они удлиняют протромбиновое время; — на их активность не оказывают влияние коллагеназа и/или эластаэа.

1512473

Формула изобретения б

) ф

Ъ

=т па

О, вп пп lzo нп ип ва гпп

У о +++ 4 g

Составитель В,Гудошников

Техред Л.Сердюкова Корректор М.Шароши

Редактор A,Äoëèíè÷

Заказ 5914/59 . Тираж 643 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина, l01 предлагаемым способом VAC-белки занимают только каталитическую поверхность факторов свертывания крови без их инактивации. Антитромбин-III инактивирует фактор Ха и тромбин в результате реакции псевдо 1-го порядка с коэффициентом скорости 0 32 мин .

Этот коэффициент у получаемых предлагаемым способом VAC-белков равен нулю, Способ получения белков с мол.м, 32000-34000, подавляющих свертывание крови, путем осаждения целевого продукта с последующей очисткой хроматографией, концентрированием и обессоливанием с помощью ультрафильтрации, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта за счет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании, в качестве сырья используют внутренние оболочки аорт или васкуляризованную ткань, предварительно перед осаждением проводят их гомогенизацию в растворе их гомогенизацию в растворе

100 ммоль/л хлористого натрия, 50 ммоль/л гидрохлорида трис-(оксиметил)-аминометана с рН 7,5, содержащем этилендиаминтетраацетат натрия, ингибитор трипсина из соевых бобов и бензамидин, гомогенат центрифугируют в течение 60 мин при 100000 g целевой продукт осаждают высаливанием сульфатом аммония, а очистку проводят хроматографией на гидроксиапатите, диализом, ионообменной хроматографией на сефацеле с диатиламиноэтиловыми группами, повторным диализом, затем проводят либо хроматографию-на сефадексе G=100 с последующим диализом,. либо гель-фильтрацию на суперозе-12, ионообменную хроматографию на анионите Моно 0 и повторную гель-фильтрацию на суперозе-12 с последующим диализом.