Способ получения фактора, ингибирующего миграционную активность макрофагов и лейкоцитов

 

Изобретение относится к иммунохимии и касается способа получения фактора, ингибирующего миграционную активность макрофагов и лейкоцитов. Цель изобретения - упрощение способа. Способ заключается в разделении периферической крови свиньи в градиенте фиколл-верографин плотностью 1,078 г/см³. Выделенную фракцию лимфоцитов обрабатывают фитогемагглютинином, культивируют, надосадочную жидкость после культивирования отделяют, отбирают бесклеточный супернатант, концентрируют ультрафильтрацией на мембранных фильтрах РМ-10 и разделяют на сефадексе G-100. Получают две активные фракции с мол.м. 60-70 кД и 20-30 кД, влияющих на подвижность фагоцитирующих клеток и ускоряющих процесс заживления ран. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии, и касается способа получения фактора, ингибирующего миграционную активность макрофагов и лейкоцитов. Цель изобретения упрощение способа. Пример 1. 400 мл периферической крови свиньи с антикоагулянтом (25 Ед/мл, гепарин, Gideon Richter, Венгрия) разводят раствором Хенкса в соотношении 1:3, наслаивают на раствор фиколлверографина плотностью 1,078 г/см³, центрифугируют 45 мин при 400 g, собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, трижды отмывают средой 199 по 10 мин при 200 g, определяют количество выделенных клеток. Получено 500 млн лимфоцитов. Доводят концентрацию клеток до 5 млн/мл, обрабатывают клеточную суспензию фитогемагглютинином (ФГА) в дозе 10 мкг/мл в течение 2 ч при 37^oC. Затем трижды отмывают от ФГА (центрифугированием при 200 g в течение 10 мин) и культивируют 20 ч во флаконах по 50 мл/флакон (объем посуды культивирования 500 мл). После окончания культивирования надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием, бесклеточный супернатант отбирают, концентрируют в специальных ячейках для концентрации с использованием фильтра РМ-10 (Amicon) в 20 раз по отношению к исходному объему и 4 мл сконцентрированного супернатанта наносят на колонку с сефадексом G-100, уравновешенную стандартным раствором Хэнкса (pH 7,0) и предварительно откалиброванную голубым декстраном (мол. м. 2 млн. Д), бычьим сывороточным альбумином овальбумином (БСА, 67 кД), яичным альбумином овальбумином (ОВА, 45 кД), химотрипсиногеном (ХТГ, 25 кД), ДНФ-аланином (297 Д). Условия проведения гель-фильтрации: V=14 мл/ч, T= 4^oC, элюент стандартный стерильный раствор Хэнкса, время сбора в 1 пробирку 15 мин. Во фракциях, собранных в области выхода белков с молекулярной массой 20-30 и 60-70 кД, определяют концентрацию белка спектрофотометрическим способом. Тестирование биологической активности ин витро проводят на модели миграции макрофагов и лейкоцитов, ин виво на модели раневого процесса кроликов. Модель миграции макрофагов и лейкоцитов ин витро. Влияние на подвижность макрофагов и лейкоцитов оценивают в капиллярном тесте угнетения миграции. В качестве мишеней использовали клетки перитонеального экссудата мышей (80% которых составляют микрофаги) и лейкоциты периферической крови здоровых доноров. Этими клетками заполняют капилляры диаметром 0,85 мм, которые помещали в ячейки 96-луночных планшет, предварительно заполненные средой RPM1-1640 (контроль) или определенным разведением исследуемого препарата в среде RPM1-1640 (опыт). После культивирования в течение 24-36 ч при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ оценивали зоны миграции клеток-мишеней (к-м) в опытных и контрольных лунках с помощью инвертированной лупы. Количественным показателем учета реакции служил индекс миграции, оцениваемый как соотношение величин зон миграции в ячейке с препаратом к зонам миграции в среде RPM1-1640: ИМ опыт/контроль. Если ИМ>0,8, то феномена ингибирования миграции не наблюдается. Если ИМ<0,8, то происходит торможение миграции соответствующих клеток-мишеней. При торможении миграции клеток происходит активация их функциональной активности, опосредуемая растворимыми медиаторами иммунитета факторами ингибирования миграции макрофагов (МИФ) или лейкоцитов (ЛИФ), присутствующими в получаемых препаратах после гель-фильтрации. Действие препаратов с мол.м. 20-30 и 60-70 кД на миграцию макрофагов перитонеального экссудата мышей и лейкоцитов периферической крови человека приведено в табл.1. Препарат с мол. м. 20-30 кД угнетает миграцию макрофагов. Эффект зависит от дозы. Доза 25 мкг/мл на 78% угнетает миграцию макрофагов (ИМ 0,22±0,05). На лейкоциты периферической крови достоверного влияния не выявлено. Поэтому эту фракцию обозначили как препарат M. Препарат с мол.м. 60-70 кД не влияет на миграцию макрофагов, но действует на миграцию лейкоцитов. Этот препарат обозначили как L. В последующих примерах для тестирования полученных препаратов использовали для L-фракции (мол.м. 60-70 кД) лейкоциты, для M-фракции (20-30 кД) макрофаги. Модель раневого процесса у кроликов ин виво. Кроликам подкожно вводят 1 млн Staphylococcus epidermidis в 0,2 мл по типу лимонной корочки. На седьмые сутки абсцесс вскрывают и проводят обработку раны путем орошения поверхности и введения препарата под дно раны в течение 10 сут 1 раз в день по 1 мл. Состояние раны оценивают по ее площади, гиперемии вокруг раны, характеру отделяемого, началу эпителизации и появлению корки, сроку наступления полного заживления раны. В результате лечения наблюдали сокращение площадей ран под действием препаратов M (мол.м. 20-30 кД) и L (мол.м. 60-70 кД) на 30-40% по сравнению с контрольной группой в первые 4 сут после начала лечения, меньшую площадь отека и геперемии (на 20-40%). Препарат L (60-70 кД) вызывает полное заживление инфицированных ран в среднем на 5 сут раньше по сравнению с контролем. Таким образом, способ получения препарата по примеру 1 позволяет выделить 2 активные фракции белков с мол.м. 60-70 кД (L-препарат) и 20-30 кД (M - препарат), влияющих на подвижность фагоцитирующих клеток и ускоряющих процесс заживления ран у кроликов. Пример 2. Из 300 мл периферической крови свиньи выделено 450 млн лимфоцитов. После доведения конечной концентрации клеток до 5 млн/мл объем клеточной суспензии составил 90 мл. Лимфоциты обрабатывают ФГА в дозе 10 мкг/мл в течение 1,5 ч. После удаления стимулятора культивируют лимфоциты 22 ч при 37^oC. По окончании культивирования клетки удаляют и бесклеточный супернатант после концентрирования до 4 мл наносят на колонку для проведения гель-фильтрации. Определив концентрацию белка во фракциях, их тестируют ( в дозе 10 мкг/мл) ин витро на наличие активности, регулирующей миграцию клеток-мишеней в капиллярном тесте, и ин виво на модели миграции макрофагов в брюшную полость у мышей. Результаты экспериментов приведены в таблицах. Содержание белка в полученных препаратах и их влияние на подвижность клеток-мишеней (ин витро) приведено в табл. 2. Модель миграции клеток в брюшную полость. Мышам (CBAxC57B1)F₁ вводят внутрибрюшинно препараты M (20-30 кД) и L (60-70 кД) в дозах 25 мкг в 0,5 мл раствора Хэнкса. Через 2,6 и 24 ч определяют количество клеток в перитонеальном экссудате. Действие полученных препаратов на миграцию макрофагов в брюшную полость (ин виво) приведено в табл. 3. Препарат M (мол. м. 20-30 кД) активирует миграцию клеток в брюшную полость примерно в 1,7 раза, начиная с 6 ч после введения (внутрибрюшинно). В то же время препарат L (мол.м. 60-70 кД) на второй час после введения резко угнетает этот процесс. Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить способ за счет применения крови свиньи и сефадекса G-100.

Формула изобретения

Способ получения фактора, ингибирующего миграционную активность макрофагов и лейкоцитов путем выделения из периферической крови лимфоцитов, стимуляции фитогемагглютинином, их культивирования, концентрирования надосадочной жидкости и гель-фильтрации на сефадексе, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве источника сырья используют кровь свиньи, а гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 20.06.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 18-2003

Извещение опубликовано: 27.06.2003        

---