Способ получения амида

 

Изобретение относится к способу получения амидов с помощью микроорганизмов, более конкретно к способу гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Для этого нитрилы, содержащие 2-6 атомов углерода, подвергают воздействию микроорганизма RHODOCOCCUS SP 5-6 FERM - BP N687, обладающего способностью гидратировать нитрилы с образованием соответствующих амидов в водной среде.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

Е ЯИЗН3

ЗАТЕИ; „ :::,щ, .рд

ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕГЕНИ5)

К flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4011809/30-13 (22) 07.01.86 (31) 452/85 (32) 08.01.85 (33) JP (46) 30, 09. 89. Бюл. Р 36 (73) Нитто Кемикал Индастриз Ко., Лтд (JP) 75) Итиро Ватанабе и Иасами Окумура (.тр) (53) 631. 841. (088. 8) (56) Заявка Франции М- 2421212, кл. С 12 D 13/Об, 1979.

Изобретение относится к способам получения амидов с помощью микроорганизмов, в частности к способам гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды, Цель изобретения — повьппение выхода целевого продукта.

Rhodococcus sp. S-6 обладает особенно высокой нитрилазной активностью, он депонирован в Исследовательском институте ферментации агенства промьппленной науки и технологии министерства международной торговли и промьппленности, Япония, под номером

FERM-BP N - 687.

Морфология. Некрупные палочки 0,50, мкм в диаметре и 1-5 мкм в длину.

На начальной стадии культивирования клетки имеют удлиненную палочкообраз„„SU„„1ßZaSS д1) 4 С 12 N 9/06. (54) СПОСОВ ПОЛУЧКНИЯ Л11ИДЛ (57) Изобретение относится к способам получения амидов с помощью микроорганизмов, более. конкретно к способам гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта. Для этого нитрилы, содержащие 2-6 атомов углерода, подвергают воздействию микроорганизма

Rhodococcus sp. S-6 РЕВИ-BP Р 687, об. ладающего способностью гидратировать нитрилы с образованием соответствующих амидов в водной среде ° 1 табл. ную форму, наблюдается нерегулярное ветвление. Затем они разламываются и расщепляются на сферические или короткие палочкообразные формы (плеоморфизм) .

° а и

Подвижность не наблюдается. М

Образование спор не наблюдается. ВВЬ

Окрашивание по Граму положительно (+). Об

Устойчивость к кислотам отрицательная (-) .

Характер роста на различных культуральных средах (30 С).

Культура на пластинах бульона на агаре: колонии круговые, неправиль- (,р ные, поверхность гладкая с легким розовым оттенком, Культура на скошенном агаре: рост хороший, поперечное сечение трапецевидное, без блеска, слегка розоватая.

3 151248

Культура на жидком бульоне: интенсивный рост во время образования пелликул, жидкость прозрачна, осадок по мере роста.

Физиологические характеристики, Восстановление нитрата: положительно (+).

Разложение мочевины: положитель— . но (+).

Выработка индола: отрицательно (-). Гидролиз крахмала: отрицатель но (-) .

Разложение желатина: отрицательно (-) .

Разложение целлюлозы: отрицательно (-).

Оксидаза: отрицательно (-).

Каталаза: положительно (+).

Потребность в свободном кислороде: положительно (+).

Рост в анаэробных условиях: отрицательно (-).

0/F тест: О.

Росу при 37ОС: положительно (+). 25

Потребность в витаминах: отрицательно (-) .

Продуцирование газа из глюкозы: отрицательно (-), Продуцирование кислоты из глюкозы: 30 положительно (+).

Химический состав клеток.

Содержит мезо-диаминопимелиновую кислоту, арабинозу и галактозу.

Содержит жирные кислоты С <6(п, Р„)„ 35

С,> (F, ) и С,, (10-СНз) в качестве основных жирных кислот.

Содержит С -С -миколовыа кисло46 ты в качестве типа миколовых кислот.

Штамм S-6 определяют как бациллу, 40 которая является грам-положительной, отрицательной по спорообразованию, аэробной, обладающей полиморфолизом и отрицательной устойчивостью к кислотам.

Этот штамм. включает в себя мезодиаминопимелиновую кислоту, арабинозу и галактозу, С „б (п,Р„), С 8 (Р ) и С,ч (10-СН ) в виде жирных кислот и

С -С -миколовые кислоты в виде мйком м 50 ловой кислоты.

На основании приведенных бактериологических характеристик настоящий штамм идентифицирует как бактерию, принадлежащую к роду Rhodacoccus, При культивировании микроорганизмов по предлагаемому способу используют обычную культуральную среду, содержащую источник углерода (например, 8 4 глюкозу, глицерин и мальтозу),источник азота (например, сульфат аммония и хлористый аммоний) и источники органических питательных веществ (например, дрожжевой экстракт,пелтон,мясной экстракт,соевый протеиновый гидролизат и жидкость после замачивания кукурузы (CSZ), источник неорганических питательных веществ (например, фосфат, магний, калий, цинк, железо и марганец) и т.д.

Такое культивирование проводят в аэробных условиях при перемешивании при рН 6-8 и 20-35 С, предпочтительно 25-30 С, в течение 1-3 дней.

На практике при осуществлении способа один из штаммов, выбранный из указанных микроорганизмов, куль— тивируют в течение 2-3 дней указанным способом, а полученные культуры или клетки выделяют из культуры или обработанные клетки (неочищенные ферменты, иммобилизованные клетки и т,д.) суспендируют в воде, буфере или физиологическом солевом растворе, а затем добавляют нитрильное соединение.

Нитрильное соединение воздействует на клетки при взаимодействии с водной средой, обычно содержацей от около

0,01 до 10 вес./ клеток и от около

0,1 до 10 вес.Х нитрильного соединения, при температуре от ее точки замерзания до 30 С, предпочтительно

7-9, в течение 0,5-10 ч.

Нитрильные соединения, используемые

1 в качестве субстрата, являются био— логически очень токсичными и оказывают вредное воздействие на ферментную реакцию. Поэтому нитрильное соедине.ние добавляют постепенно, контролируя, чтобы концентрация нитрилов в системе предпочтительно не превышала

2 вес.X.

Если рН находится за пределами указанного интервала значений, образующийся и накапливающийся амид далее гидролизуется и стабильность клеток понижается. Поэтому предпочтительно контролировать значение рН в интервале 7-8 путем постепенного добавления каустика (например, NaOH и КОН) или путем предпочтительного добавления к системе буфера.

Если условия реакции контролировать соответствующим образом, целевой амид можно получить и выделить из нитрильного соединения с конверсией приблизительно IOOX и практически без обра-! зования побочных продуктов.

1512488

Образовавшийся амид можно выделить из реакционной смеси обычными способами, например клетки выделяют из реакционной смеси с помощью центрифу5 ги, обработкой активированным углем или ионообменной смолой и т.д., а затем концентрируют при пониженном давлении до получения целевого амида, например акриламида. l0

Различные нитрилы и соответствующие им амиды количественно анализируют с помощью газовой хроматографии, а соответствующие им органические кислоты — с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, Пример 1. Штамм Rhodococcus

sp, S-6 культивируют в аэробных условиях на среде (рН 7,2), содержащей вес.Х: глюкоза 1, пептон 0,5, дрожже- 20 вой экстракт 0,3 мясной экстракт 0,3 при 30 С в течение 48 ч. Образующиеся при этом клетки выделяют с помощью центрифуги и промывают 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,7), Эту процедуру 25 повторяют до получения промытых клеток штамма S-6 (содержание,воды 80Х), Приготавливают смесь 0,5 вес.ч, промытых клеток и 84,5 вес.ч. 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,5), а затем

15 вес.ч. акрилонитрила добавляют по о частям при перемешивании при 0-3 С, контролируя условия таким образом, чтобы концентрация акрилонитрила в ре.акционной системе не превышала 2Х т,е. не подвергая акрилонитрил реакции гидратации. Добавление акрилонитрила завершают примерно через 3 ч.

Для обеспечения завершения реакции 40 перемешивание продолжают еще в течение нескольких часов.,Затем клетки выделяют с помощью центрифуги до получения прозрачного раствора. Этот раствор содержит, 20% акриламида, вы- 4 ход акриламида превышает 99,9%.Непрореагировавший акрилонитрил вовсе не . детектируется, а содержание побочных продуктов акриловой кислоты не превышает 0,1% (в расчете на вес акриламида) .

Воду отгоняют из прозрачного раствора при температуре не более 50 С, прозрачный раствор концентрируют до осаждения кристаллов. Эти кристаллы перекристаллизовывают из метанола до получения бесцветных пластинкообразных кристаллов. Это соединение оп ределяют как акриламид на основании

10

2,5

2.,0 температуры плавления, элементного анализа и данных ИК.

Пример 2. Промытые клетки штамма S-6 получают так же, как в примере f и определяют их реакционную способность по отношению к различным нитрилам в следующих условиях.

Условия реакции:

Нитрильное соединение, Х 2,5

Калийфосфатный буфер (рН 7,7), М 0,05

Клетки (в виде сухих клеток),мг о

Температура, С

Время реакции,мин

Количество реакционного раствора, мл 10

Результаты реакции приведены в таблице.

Пример 3. 100 мл культуральной среды, содержащей вес.Х: глицерин 1, КН РО+ 0,1, М8$0 7Н О 0,05, Fe$0< ° 7H<0 0,001, соевый белковый гидролизат 0,5, дрожжевой экстракт (рН 7,5) 0,1, который стерилизуют и к которому добавлено 0,5%. стерильного изобутиронитрила, приготавливают в

Эрленмейеровской склянке емкостью

500 мл. Затем добавляют 1 мл культуры типа культурального штамма, которую культивируют в течение 48 ч в такой же культуральной среде, что и в примере l и культивирование ведут при вибрации при 25 С в течение 48 ч.

После завершения культивирования клетки выделяют с помощью центрифуги, а затем промывают 0,05 И фосфатным буфером (рН 7,7). Эту процедуру повторяют до получения промытых клеток.

Определяют активность этих клеток по образованию акриламида из акрилонитрила так же, как в примере 2.

Полученные результаты:

Тип штамма Активность при образовании акриламида, мкИ/мг ч

Rhodococcus crythroyo1is IFM l55 3,5

Rhodococcus rhodochrous IFM 153

Arthrobacter oxydans

IF0 12 !38 5,0

Arthrobacter aurescens ХАМ 12340

Microbacterium

flavum IAN 1642 2,0

1512488 уормулаиз обретения

Способ получения амида путем биотрансФормации нитрила штаммом бактерий в буФерном растворе при постоянных рН и температуре, о т л и ч а юОтносительное значение по отношению к акрилонитрилу в качестве 100

Составитель И.Тареева

Техред JI.Ceðäþêîâà Корректор Л.Патай

Редактор A,Îãàð

Заказ 5914/59 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Лцетонитрил

Пропионитрил

Акрилонитрил

Метакрилонитрил

Бутиронитрил

Валеронитрил

Никотинонитрил

3

4

5

6 шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, биотрансФормации подвергают нитрил с 2-6 атомами углерода, а в качестве бактерии испольsyro штамм Rhodococcus

sp. S-6 FERM-BP N - 687.

102

123

51

11