Способ определения над-зависимой формиатдегидрогеназы

 

Изобретение относится к биохимии, в частности к анализу формиатдегидрогеназы в клетках и растворах и может найти применение в микробиологической промышленности, медицине, а также в научных исследованиях. Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа, упрощение и ускорение процесса. Способ определения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы предусматривает частичное разрушение оболочки клеток микроорганизмов замораживанием-размораживанием или обработкой лизоцимом или катионным поверхностно-активным веществом в растворе глицерина или сахарозы с последующей детекцией НАДН биолюминесцентным методом в присутствии иммобилизованных НАДН<SB POS="POST">2</SB>:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы BENECREA HARVEYI. Способ позволяет определять нативный фермент в целых клетках бактерий и дрожжей, имеет достаточно высокую чувствительность (10<SP POS="POST">-1</SP>°М), кроме того, формиатдегидрогеназа может быть обнаружена в микроколичествах исходной биомассы, что особенно важно при анализе генных клонотек. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1518376 А 1 (50 4 С 12 Ц 1/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4341088/31-13 (22) 11. 12. 87 (46) 30 ° 10.89. Бюл. 11 40 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) Т.В.Авилова, О.А.Егорова, О.В.Лебедева, В.Е.Карэанов, Н.Н.Угарова и A.М.Егоров (53) 577.15(088.8) (56) Avilova T.×. et а11. Biosynthesis purificst on and propertie s of

formate Йе1 уйгодепа e Тгош yeasts

Candida methylica. — Eur. J. Riochem, 1985, ч.15> р. 657-66?, Etorov А.М. at а11 . NaD-dependent

Formate dehydropenase from ше1йу1оtrophic bacterium 51rain 1.Purifical.

tion and characterization. — Eur.

В1осйеш, 1979, v.99, р, 569-576, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАД-ЗАВИСИМОИ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к анализу формиатдегидрогеназы в клетках и растворах, и может найти применение в микробиоИзобретение относится к микробиологии и биохимии, в частности к способу определения НАД-зависимой формиатдегидрогенаэы в растворах, бесклеточных экстрактах и целых клетках микроорганизмов, и может найти применение в медицинской, фармацевтической и микробиологической промыпшенности, а также в научных исследованиях °

2 логической промьппленности, медицине, а также в научных исследованиях.

Цель изобретения — расширение функциональных возможностей способа, упрощение и ускорение процесса. Способ определения НАД-зависимой формиатдегидрогенаэы предусматривает частичное разрушение оболочки клеток микроорганизмов замораживанием-раэмораживанием или обработкой лиэоцимом или кэтиониым поверхностно-активным веществом в растворе глицерина или сахароэы с последующей детекцией

НАГАН биолюминесцетным методом н присутствии иммобилиэованных НАДН .ФМНоксидоредуктаэы и люцифераэы БепесКеь д

harveyi. Способ позволяет определять нативный фермент в целых клетках бактерий и дрожжей, имеет достаточно

rd высокую чувствительность (10 М), кроме того, формиатдегидрогеназа может быть обнаружена в микроколичествах исходной биомассы, что особенно важно при анализе генных клонотек.

1 табл.

Цель изобретения — расширение функциональных возможностей способа, упрощение и ускорение процесса.

Предлагаемый способ включает нарушение целостности клеточной оболочки в 10-20Х-ном растворе сахароэы или 20-307-ном растворе глицерина

I замораживанием-раэмораживанием или обработкой лиэоцимом в концентрации

1-2 мг/мп, или воздействием катион1518376

35 ного поверхностно-активного вещества и концентрации 0,001 -0,01 мг/мл суспензии. Детекцию НАДН, образующегося при ферментативной реакции, проводят биолюминесцентным методом в присутствии иммобилизованных НАДН1.ФМН оксидоредуктазы и люциферазы.

Предлагаемый способ позволяет определять формиатдегидрогенаэу в целых клетках микроорганизмов, что расширяет технологические возможности способа и значительно упрощает процесс по сравнению со сгектрофотометрическим методом, связ .иным с необходимостью получения бесклеточного экстракта центрифугированием клеточной суспенэии.

Обработка бактерий и дрожжей в растворе сахароэы или гл:1церина перечисленными способами в отличие от действия ультразвуком не приводит к полному разрушению клеточной стенки и выходу формиатдегидрогеназы в раствор, а лишь частично разрушает 25 ее, образуя каналы, через которые осуществляется свободная диффузия субстрата и кофактора. Формиатдегидрогеназа остается внутри клетки в этих условиях в течение длительного времени сохраняет свою активность, что позволяет определять черезвычайно малые концентрации фермента паже в случае высоколабильного фермента.

Применение сахарозы или глицерина способствует также равномерному распределению клеток в объеме, что гарантирует надежность и воспроизводимость результатов. Снижение кон- 40 центрации сахарозы (ниже 10 мас. ) или глицерина (ниже 20 об. ) приводит к частичному осаждению клеток, а увеличение концентрации ..сахарозы и глицерина вьппе укаэанных пределов 45 снижает скорость ферментативной реакции эа счет увеличения вязкости раствора, причем и в том, и в другом случаях уменьшается чувствительность метода.

При разрушении клеточной стенки под действием лиэоцима используют концентрации 1-2 мгlмл клеточной суспенэии. Уменьшение концентрации лиэоцима ниже 1 мгlмл суспензии уменьшает чувствительность метода, использование концентрации ньппе 2 мг/мл суспенэии нецелесообразно, так как не влияет на чунстнительность метода, Для нарушения целостности клеточной оболочки можно использовать поверхностно-активные вещества катионной природы, тогда как применение анионных или неионных поверхностноактинных веществ не являетсн эффективным. Б качестве катионного поверхностно-активного нещестна могут использоваться петилтриметиламмоний бромид, цетилпиридиний хлорид, цетилэтилдиметиламмоний бромид и т,д. и концентрации 0,001-0,01 мг/мл суспенэии клеток ° При использовании кон— центрации ниже 0,001 мг/мл уменьшается чувствительность анализа, при увеличении концентрации выше

0 01 мг/м11 происходи1 инак Г11вация иммобилиэованньгх Н.ЯН :Ф!",Н вЂ” оксидоредуктаэы и люциферазы, что также приводит к уменьшению чувст11ител1-Нооти анализа.

Биолюминесцентньп1 метод с нспол1— зованием НАДН<. ФМН вЂ” оксидоредуктаэы и люциферазы позволяет определять формиатдегидрогеназу н ь?1етк11х растворах в концентрации до 0 М.

Для этого к клеточ ной сус пен в 1 пли раствору, содержащему формиатдег11Л11огеназу, добанля1от НЛЛН,: Ф111! -- оксидоредуктазу и люцнфе1?азу Г 1е"..kca

hardie совместно иммобил11э1 в,11 ные на B:Cl -агароэе, и субстр-ты этих ферментов-флавинмононуклеотид (МН) и деканаль. Иммобилиэацня Ы, .111;.ФМН оксидоредуктазы и люциферазы Н .-«.=.о!1еа

ha veyi приводип к значительной стабилизации 11х фермент?гинной,1к1ивн?c— ти и условиях данной реакции 11ммобилизацию НАДН . ФМН вЂ” окси11оре..уктазы и люциферазы БепесКеа 1.ь ",.;„. осуществляют инкубацией экс1ракта кле ок с агароэой, актинироьанной Ьг011.

Пример I, Определение активности формиатдегидрогеназы в целых клетках Pseudomonas .sp. 101, В качестве продуцента использбют штамм метилотрофных бактерий э.-lldomonas sp lOI BKM В-1545,11 Института микробиологии АН СССР. Клетки !0 /мл суспендируют в 0,5 М калийфосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 15,. сахарозы, и подвергают последонательному о замораживанию при -20 С и раэмораживают при 25 С. 2 мл полученной суспензии помещают н кювету люми«ометра, добавляют !00 мкл 0,25 нМ раствора

ФМН в воде, IOO мкл 0,5 н 1 раствора деканаля в 2%-ном растворе изопропа5 15183 кола и IOO мкл суспензии иммобилиэованных НАДН . ФИН вЂ” оксидоредуктазы и люцифераэы Beneckea harveyi. Добавляют 100 мкл 25 нМ раствора НАД в наде. и регистрируют фоновое свечение. 3атем добавляют 100 мкл 3 М раствора формиата натрия и регистрируют свечение. Интенсивность свечения, определенная по разности между интенсивностью сигнала в присутствии формиата натрия и н отсутствии последнего, составляет 20 мВ н 1 мин, что соответствует 4 10 " М формиатдегидрогеназы. 15

Пример 2. В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспенэии по примеру 1, но в 10 -ном растворе сахароэы, Добавляют 100 мкл 0,25 нИ раствора ФМН в воде и остальные реа- 20 генты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 18 мВ в 1 мин, что соответствует 3,6 -10 "М формиатдегидрогеназы.

Пример 3. В кювету люминомет- 25 ра помещают 2 мл клеточной суспенэии по примеру I но н 107.-ном растворе сахаНозы. Добанляют IOO мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность 30 свечения составляет 22 мВ в 1 мин, что соответствует 4,4-10 М формиатдегидрогенаэы.

Пример 4. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной сус35 пензии по примеру I но в 57.-ном растворе сахароэы. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ растнора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1 ° Интенсивность свечения составляет 11 мВ в 40

1 мин, что соответствует 2,2 .10 " формиатдегидрогеназы.

Пример 5. В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспензии по примеру 1, но в 307-ном растворе сахарозы. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1 ° Интенсивность свечения 12 мВ н 1 мин, соответствующая 2,4 10 М формиатдегидрогенаэы.

Пример 6. В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспензии по примеру I, но в 207-ном растворе глицерина., Лобавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФМН н воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсинность свечения составляет 22 мВ н

76 ° 6

1 мин, что соотнетствуeò 4,4 10 " формиатдегидрогеназы.

Пример 7. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но и 257.-ном растворе глицерина. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1, Интенсивность свечения составляет 21 мВ н 1 мин, что соответствует 4,2 -10Г" !1 формиатдегидро-геназы, Пример 8. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии;по примеру 1, но в ЗОБ-ном растворе глицерина. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения составляет 20 мВ в мин, что соответствует 4,0-10 " M формиатдегидрогенаэы.

Пример 9. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру I, но в 10 7.-ном растворе глицерина. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФИН н воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 15 мВ в

go

1 мин, что соответствует 3 1Т M фермента.

Пример IO. В кюнету люминометра помещают 2 мл клеточной суспенэии по примеру 1, но в 407-ном глицерине ° Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН н воде и остальные реагенты ло примеру 1. Интенсивность свечения составляет 14 мВ н 1 мин, что (,соответствует 2,8.10 "И формиатдегидрогенаэы.

Пример 11, В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспензии Pseudomonas sp. 101, содержащей

10 клеток на 1 мл и 15Е-ной сахаро5 зы, и добавляют 2 мг на 1 мл лиэоцима.

Добавляют 100 мкл 0,25 нИ раствора

ФМН в воде и остальные реагенты по примеру l, Интенсивность свечения

-fa составляет 18 мВ н 1 мин или 3,6-10 И фермента.

Пример 12 ° В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру ll а лизоцима добавляют 1 мг на I мл. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФИН н воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения составляет lá мВ в

1 мин, что соответствует 3,() 10 М фермента.

1518376

Пример 13. В кювету люминометра помещают 2 ил клеточной суспензии по примеру Il, а лизоцим добавляют в количестве 3 мг на 1 мл. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру ). Интенсивность свечения составляет 18 мй в 1 мин, что соответствует 3,6 .10-"М формиатдегидрогенаэы. Ip

Пример !4. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспенэии Pseudomonas sp. 101, содержащей 10 клеток в 1 ил 0,5 М калийфосфатного буфера, содержащего 15Х !5 сахароэы, и добавляют 100 мкл

0 ОIХ-ного раствора катионного поверхностно-активного вещества цетил триметиламмоний броиида. Добавляют

)00 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде 20 и остальные реагенты по примеру 1.

Интенсивность свечения составляет

24 мВ в 1 иин, что соответствует

4,8 -!О М формиатдегидрогеназы.

Пример 15. В кювету люмино- 25 метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 14 и добавляют

100 мкл 0,005 -ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в 3р воде и остальные реагенты по примеру

1. Интенсивность свечения равна

22,8 мВ в 1 иин или 4,6.10 " M формиатдегидрогеназы.

Пример 16. В кювету люиинометра помещают 2 ил клеточной суспензия по примеру 14 и добавляют

100 икл О,ОООIХ-ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в 40 воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения равна

22 мВ в ) иин или 4,4 -10 " М формиатдегидрогеназы.

Пример 17 ° В кювету люмино- 45 метра помещают 2 ил клеточной суспензии, содержащей 10 клеток в

1 мл 0,5 М калийфосфатного буфера, содержащего 15 сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,0005 -ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют IOO мкл 0,25 нМ раствора

ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения

Равна 18 мВ в иин или 3,6 10 М формиатдегидрогенаэы, Пример IH. В кювету люминоиетра помещают 2 мп клеточной суспензии Pseudomona", sp. 101, содержа. щей 10> клеток в 1 мл О,l М калийфосфатного буфера, содержащего

15Х сахарозы, и добавляют 100 икл

0,02Х-ного раствора цетилэтнлдиметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения 15 мВ в 1 иин, что соответствует 2,8 l0 "М формиатдегидрогеназы.

Пример 19. Определение фор миатдегидрогенаэы в целых клетках метилотрофных дрожжей Candida methylica ИБФМ У-670.

В кювету люиинометра помешают

2 мл клеточной суспензии Candida

methylica в 0,1 M калийфосфатном буфере, содержащей 10 клеток и

15Х сахарозы, и добавляют 100 мкл

0 0) -ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл

0,25 М раствора ФМН и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения 24 иВ в 1 мин или 4,8 -IO " M формиатдегидрогеназы.

Пример 20. Определение НАДзависимой формиатдегидрогенаэы в целых клетках Escherichia coli.

В кювету люминометра помещают.

2 ил клеточной суспензии Е, coli, содержащей 10 клеток в 1 мл O,l М калийфосфатного буфера и 15Х сахарозы, и добавляют 2 мг лизоцима. Добавляют )00 мкл 0,25 нМ раствора

ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения равна О, т.е. НАД-зависимая формиатдегидрогеназа в клетках Е. coli отсутствует.

Пример 21. Определение НАДзависимой формиатдегидрсп енаэы в целых клетках Zactobacillus casei.

В кювету люминоиетра помещают 2 ил клеточной суспензии, содержащей

10 клеток в 1 мл 0,1 М калийфосфатного буфера и )5X сахароэы, и добавляют 2 мг лизоцииа. Добавляют 100 мкл

0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения равна О. НАД-зависимая формиатдегидрогенаэа в клетках

Zactobacillus casei отсутствует.

Пример 22. Определение НАДзависимой формиатдегидрогеназы в растворе (бесклеточном экстракте).

В кювету люминометра помещают

2 мл раствора О,l М калийфосфатного буфера, содержащего формиатдегидроin

1518376 геназу. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения (мВ в минуту) определяют для различных концентраций фермента.

В таблице дана интенсивность свечения в зависимости от концентрации

1 формиатдегидрогеназы в растворе.

Номер Концентрация Интенсивность фермента, М свечения, мВ/мин

Формула изобретения

2

4

0,8 i0

1,6 10 "

2)4 1Î "

3,2.10 "

4810"

4,2

7,2

9,6

l4,9

19,8

Составитель А.Карякин

TexpeP, H.Õoäàíè÷ Корректор В.Гирняк

Редактор M.Ïåòðoâà

Заказ 6568/31 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101

Предлагаемый способ позволяет определять нативный фермент в целых клетках бактерий и дрожжей, имеет достаточно высокую чувствительность определения НАД-зависимой формиатдегидрогенаэы (10 М) и, что особенно важно для анализа генных клонотек, представленных несколькими тысячами генно-инженерных штаммов, фермент может быть обнаружен в микроколичестI вах исходной биомассы (для прове4 дения одного анализа достаточно 10 клеток). Последнее особенно важно в том плане, что осуществление процесса наращивания биомассы для определения активности НАД-зависимой формиатдегидрогенаэы по методу, указанному в прототипе, может носить принципиальные сложности в связи с проблемой экспрессии генов ° Преимуществами предлагаемого метода являются также быстрота определения (2-3 мин) и возможность автоматизации процесса измерения, что также

10 имеет принципиальное значение при серийных анализах.

15 Способ определения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы микроорганизмов, включающий нарушение целостности клеточной оболочки, последующую детекцию НАДН, образующегося в реэуль20 тате ферментативной реакции, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью расширения функциональных воэможностей сйособа)упрощения и ускорения процесса, нарушение клеточной обо25 лочки проводят в растворе сахароэы с концентрацией 10-20Х или в растворе глицерина с концентрацией 20-30Х замораживанием-раэмораживанием, или обработкой лизоцимом в концентрации

30 1-2 мг/мп, или воздействием катионного поверхностно-активного вещества в концентрации 0,001-0,01 мг/мп, а детекцию НАДН проводят биолюминесцентным методом в присутствии иммоби35 лизованных НАДН:ФМН вЂ” оксидоредуктазы и люцифераэы.